目的基因导入受体细胞.pptVIP

转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转化子的出现，因此须设以下几种对照处理：DNA对照处理。转化处理液中用0.2ml无菌水代替0.2m1感受态细胞，检验DNA溶液是否染菌。感受态细胞对照处理。转化处理液中用0.1mlNTE缓冲液代替0.1m1DNA溶液，检验感受态细胞是否染菌。感受态细胞有效性对照处理。在0.2ml感受态细胞中加入0.1ml已知容易转化这种感受态细胞的质粒DNA。（2）电穿孔转化法基本原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔(electroporation)．形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。01电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每ugDNA可以得到109－1010转化子。02研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致50％-70％细菌死亡时，转化水平达到最高。03用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备容易得多．当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用10％甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×l010个／m1。分装，在干冰上速冻后置于－70℃贮存。这样，每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达6个月以上。01电穿孔转化须在低温下(0－4℃)进行，转化效率要比在室温下操作提高约100倍。02（3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌简称为三亲本杂交转移法，是基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方式．适用于那些难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法转化的受体菌。非接合型质粒分子较小，缺少编码质粒转移体系所须的全部基因，不能象接合型质粒那样在宿主细胞间自我转移。但如果在宿主细胞中存在另外一种溶合性的接合型质粒（即辅助质粒），非接合型质粒通常也会被转移，这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程称为迁移作用。12接合型质粒分子较大，自我转移的随意性强，转移过程中经常伴随着宿主细胞染色体的高频转移，因此难以作为基因工程载体使用。目前常用的质粒载体多是在非接合型质粒或缺失了接合转移基因的接合型质粒的基础上构建的，故重组质粒DNA分子也不能直接进行接合转化．而只能通过其迁移作用来完成。首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，因此称为三亲本杂交接合转化法。（4）转化率的计算及其影响因素转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方式：一是以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示；二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。用每单位质量的DNA分子获得的转化子数来表示，难以反映分子大小与转化率之间的关系。0102以用于转化处理的受体细胞数为基数来计算转化率，首先必须通过菌液OD值测定或细菌计数，计算出用于制备感受态细胞的受体菌总数。然后计算转化子与受体菌的比率。影响转化率的因素分子质量较小的重组质粒DNA分子转化率较高，分子质量较大的重组质粒DNA分子转化率较低，对于大于30kb的重组质粒则很难进行转化。组成重组DNA分子的载体类型及其构型。与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体，而处于自然双螺旋闭环结构的质粒载体比开环结构成线性结构的质粒载体有更高的转化率。经体外酶切、酶连操作后的载体DNA或重组DNA分子由于空间构象难以恢复，转化率一般要比具有超螺旋结构的质粒低两个数量级。重组DNA分子的浓度和纯度。在10ng／100u1以下的DNA浓度范围内，转化效率与DNA分子数成正比关系。同一重组质粒DNA分子转化不同的受体菌细胞，转化率不同——受体细胞的选择对于重组DNA分子的转化也是极为重要。前述三种转化方法中，最佳转化率以电穿孔法最高（108~1010）；Ca2+诱导转化法居中（107~108）；而三亲本杂交转移法最低（104~105），但它适于前两种方法难以转化的受体菌。在转化操作方而，受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大。如Ca2+诱导大肠杆菌转化法，菌龄、Cacl2处理时间、感受态细胞的保存期以及热激时间均是重要的影响因素。电穿孔转化法中，对受体细胞进行冰冻甘油预处理后的转化率，要比不经此预处理的转化率高10~100倍。0201036.2.2重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌01将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的