细胞凋亡与免疫.ppt

形态学方法光学显微镜观察样品涂片或组织切片经常规处理、HE染色后,即可放在油镜下观察。该方法简便,缺点是只有在发现了具有特征性的凋亡小体时才能确定为荧光结果阳性,因而不易检出早期的凋亡细胞,而且某些类型的细胞坏死(如凝固性坏死)与细胞凋亡形态相似,两者不易区分。因此,该方法只能作为细胞凋亡初步推测的手段。*这种方法适用于对体外培养细胞悬液的检测,组织脱蜡切片经RNA酶作用后也可用此法染色观察。形态学方法荧光染料吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)、溴化乙锭(EB)等染色,在荧光显微镜下可观察到凋亡细胞的细胞核改变和凋亡小体的形成。荧光显微镜观察：荧光显微镜检查法方便易行,现已成为细胞凋亡检查的常用手段。Onthisslidetheeasiestandhistoricallyfirstwayofidentifyingapoptoticcellsisshown.InthisassaythebluefluorescentdyeDAPI(4,6-Diamidine-2-phenylindoledihydrochloride)hasbeenused,whichspecificallystainsDNA.态学方法01透射电子显微镜观察：02凋亡细胞在电子显微镜下可见细胞体积变小,细胞质浓缩,内质网、线粒体增多,细胞膜微绒毛消失、起泡、出芽、形成凋亡小体。超微结构观察是诊断细胞凋亡最可靠的方法。03但该法只能定性,不能定量,而且观察到凋亡小体的几率也不高,在体内试验时,凋亡小体可能很快被巨噬细胞吞噬清除,而不易观察到;此外,用电子显微镜检测细胞凋亡,样品制备步骤繁琐、耗时、昂贵。04*形态学方法01共聚焦激光扫描显微镜检测：02共聚焦激光扫描显微镜是20世纪80年代发展起来的一种新型仪器,是在荧光显微镜的基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使紫外光和可见光激发荧光探针,从而得到清晰的细胞内部结构。03该方法能用于细胞的形态学分析,而且还能对凋亡细胞内的大分子进行定位。04生物化学方法：典型的细胞凋亡显示出DNA梯形电泳图谱：细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成180～200bp长的DNA片段或整数倍的寡核苷酸片段。凋亡细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的梯形电泳图谱,而坏死细胞电泳后呈模糊的涂片状细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0h2．细胞色素c诱导1h3．细胞色素c诱导2h4．细胞色素c诱导3h5．细胞色素c诱导4h6．阴性对照7．Marker（自赵允、翟中和）**生物化学方法：原位末端转移酶标记技术：凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活，核DNA被切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点(缺口)，暴露出大量3’末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将标记的-dUTP进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。物化学方法：由DNA片段末端标记技术发展而成的TUNEL法[terminadeoxynucleotibyltransferase(TdT)-mediateddUTP-biotinnickendlabelling,TUNEL]及试剂盒化,使细胞凋亡的原位检测在诸多领域的研究中得到广泛应用。TUNEL法原理*细胞凋亡其断裂DNA断端3′-OH暴露(坏死细胞DNA断裂是无规则的,其中也有少数可出现3′-OH的暴露,但数量极微弱,不易检测出来);在末端DNA转移酶(TdT)的作用下,在无需模板的情况下,可进行3′端的DNA合成;如果在反应体系中加入标记的DNA,则在3′端出现一段带有标记物的寡核苷酸,通过荧光显示或其他显色反应,可以原位地较特异地显示发生凋亡的细胞。以酶原的形式存在，需要活化：同源活化和异源活化,活化后形成四聚体的蛋白水解酶，发挥生物学作用C端同源区存在半胱氨酸激活位点Caspase活化机制：Caspase的活化是有顺序的多步水解的过程，虽然分子各异，但是它们活化的过程相似。首先在caspase前体的N-端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N-端前肽，然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，并进而形成两两组成的有活性的四聚体,*凋亡细胞的特征性表现：包括DNA裂解为200bp左右的片段，染色质浓缩，细胞膜活化，细胞皱缩，最后形成由细胞膜包裹的凋亡小体，