肿瘤的分子诊断.ppt

突变体富集PCR（mutant-enrichedPCR）利用癌基因或抑癌基因某个编码子部位存在已知的限制性内切酶位点，用连续二次的巢式PCR来扩增包括存在酶位点编码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。变性梯度凝胶电泳法（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）双链DNA在变性梯度聚丙烯酰胺凝胶中电泳，凝胶中自上而下所含变性剂浓度线性增长，DNA片段进行到变性剂某一浓度，与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，但解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同时间解链，则因影响电泳速度变化的程度而被分离。在DGGE基础上，又发展了用温度梯度代替化学变性剂的TGGE法（temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE），由于DGGE和TGGE是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，均需专用的电泳装置。02化学切割错配法（Chemicalcleavageofmismatch,CCM）基本原理：将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或RNA片段混合变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺或哌啶切割，错配的T能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳可确定是否存在突变。01该法检出率很高，也是检测片段最长的方法。应用荧光检测系统可增强敏感度。该法中的化学试剂有毒，故又发展了碳化二亚胺检测法（Carbodiimide，CDI），CDI为无毒物质。等位基因特异性寡核苷酸分析法(allele-specificoligonucleotideASO)设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR扩增的样品DNA杂交。可以选用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表示样品中存在与该ASO探针相应的点突变。DNA芯片技术（DNAChip）1基本原理：2将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在一块固体材料如玻璃片、硅片（集成电路板）上，彼此之间重叠一个碱基，并覆盖所需测定的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA分别与两块DNA芯片杂交，由于至少存在一个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚焦显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变。3可用于基因定位、DNA测序、物理图谱和遗传图谱的构建等，在基因突变检测方面DNA芯片也有广阔的前景。4RNA酶A切割法01制备RNA探针，与待测DNA或RNA片段杂交，在一定条件下，异源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA的错配碱基可被RNaseA切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。02该法可用于1-2kb的大片段进行检测，并能确定突变位点。03染色体分析（analysisofchromosome）荧光原位杂交技术（FISH）寡核苷酸引物原位DNA合成技术（OligonncleotideprimedinsituDNAsynthesis,PRINS）重复引物原位标记技术（repeatedPRINS）多色原位引物标记（multicolorPRINS）用不同的非同位素标记物，分别标记被检测的基因组DNA（常为肿瘤DNA）和正常人基因组DNA，两者以1：1混合后制备探针，共同与正常人中期染色体标本进行染色体原位抑制杂交，杂交后对不同荧光物分别进行检测，以每条染色体长轴各位点的被测DNA与正常基因组DNA荧光强度比，反映两组DNA不同序列的拷贝数。基本原理：比较基因组杂交（comparativegenomichybridization,CGH）只能检测肿瘤基因组中相对于正常基因组平均拷贝数的变化，而不能检测易位、倒位及其它拷贝数没有变化的染色体畸变，基因重排和点突变，也不能检出小于2Mb的缺失。DNA序列分析（DNAsequencing）01应用各种突变检测技术检测到的基因突变，最后都需要用DNA序列分析才能确定突变的类型及突变的位置。02直接测序法（directsequencing，DS）03PCR循环测序法04双脱氧终止法基本原理第三节01限制性酶切片段长度多态性分析02等位基因不平衡应用同一肿瘤的正常体细胞（常分为血细胞或肿瘤旁正常组织）和肿瘤细胞的DNA，检测DNA多态性座位上等位基因不平衡性。当两个等位基因的相关性密度在正常与肿瘤细