细胞免疫检测技术.ppt

B细胞增殖能力的试验（一）不同刺激物诱发增殖试验抗IgM抗体和细菌脂多糖均能刺激B细胞增殖，培养1～3天以后，加3H-TdR，与淋巴细胞增殖试验一样，检测细胞内cpm，计算促有丝分裂原对淋巴细胞的刺激指数。也可用台盼蓝法计细胞增殖或用DNA特异性染色观察胞内DNA或RNA的分化程度。（二）葡萄球菌诱导试验葡萄球菌CowenⅠ株（SAC）表面富含SPA。该试验不依赖T细胞的参与，操作原则是将SAC与淋巴细胞按一定比例混合，按增殖试验法同样操作和计数cmp值。葡萄球菌表面SPA含量与激发B细胞转化能力成正比。1.称0.25g琼脂糖，加12.5ml蒸馏水，沸水内加热溶化，冷至47℃；2.另取Hanks液2ml，10%明胶25ml和蒸馏水8ml，混匀后加7%的NaHCO32滴；3.将二者混匀倒板。在琼脂板上打孔，孔径3mm，孔间距2～3mm；4.中央孔内加中性粒细胞悬液10μl，左侧孔内加10μl趋化因子，右侧孔内加10μl对照液；5.将琼脂糖板放入湿盒内，于37℃，5%CO2条件下温育4～8h；6.待孔中液体干后用甲醇固定30min，琼脂糖膜用Giemsa染色。结果分析用显微测微器测量细胞从中央孔向左侧孔的移动距离A，以及向右侧孔的移动距离B，趋化指数为A/B。中性粒细胞功能硝基蓝四氮唑（NBT）还原能力的测定硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验：本法用以检测中性粒细胞的胞内杀菌能力，由于中性粒细胞在杀菌过程中能量消耗剧增，耗氧量亦随之相应增加，磷酸己糖旁路代谢活力增强，葡萄糖6-磷酸氧化脱氢，此时加入NBT可接受所脱的氢，使原先呈淡黄色的NBT还原成点状或块状甲朊颗粒并沉积在胞浆内。操作方法1.分离中性粒细胞，调整细胞浓度至107/ml；2.按下表依次加样：静止时NBT的还原能力激活时NBT的还原能力0.1%白明胶-Hanks液0.25ml0.1%白明胶-Hanks液0.2ml0.01mol/L?KCN????0.1ml0.01mol/LKCN???????0.1ml0.1%?NBT0.4ml0.1%?NBT0.4ml??酵母多糖处理血清0.05ml＋中性粒细胞（107/ml）0.25ml＋中性粒细胞（107/ml）0.25ml3.放37℃反应15min，加0.5mol/LHCl10ml，2000r/min离心15min，弃上清；4.加呲啶2ml，沸水煮10min，2000r/min离心10min，测OD515值。结果分析中性粒细胞的功能强弱与呈色反应的深浅成正比。激活巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经37℃预温的正常兔血浆和CaC12混合液，加入经粘附单层巨噬细胞的试管中，移置37℃，即时记录血浆凝固时间。实验证明当巨噬细胞与LPS、肿瘤相关抗原或HbsAg等温育后，可见血浆凝固时间明显缩短。本法稳定方便，也是检测不同疾病患者巨噬细胞功能的指标之一。第一节E花环试验

ErythrocyteRosetteTest第二十五章细胞免疫检测技术E-花环实验原理豚鼠T细胞表面有E受体=CD2.家兔红细胞（RBC）表面有CD2的配体，即CD58.将淋巴细胞与RBC按一定比例混合后，在一定条件下就形成一个T细胞结合多个SRBC的玫瑰花一样的花环，即E-花环(erythrocyterosette)，取样涂片染色、镜检计数可得花环形成率。CD2andCD58smilarstructure?ligandofCD2---CD58ligandofCD58---CD2?CD2alsocalledSRBC-R(绵羊红细胞受体)第二节淋巴细胞的功能检测淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定010201淋巴细胞T细胞（负责细胞免疫功能）B细胞（执行体液免疫功能）NK和K细胞（非特异性免疫作用）一、T细胞功能的检测T细胞增殖试验T细胞分泌功能测定T细胞介导的细胞毒试验体内试验原理：淋巴细胞DNA合成刺激物母细胞细胞变大分化细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松（一）T淋巴细胞增殖试验PHA------T细胞01非特异性刺激物：03异种抗原同种组织抗原特异性刺激物：02PWM-------T、B细胞LPS-------B细胞ConA---