Djusp7基因在日本三角涡虫再生中的功能研究.pdf

摘要

去泛素化酶家族在多种动物中调控细胞增殖、分化、凋亡，参与肿瘤的发生发展。

其中泛素特异性蛋白酶7（ubiquitinspecificproteases,USP7）可介导底物蛋白质去泛素

化，阻止靶蛋白被过度降解，是癌症潜在的治疗靶点。日本三角涡虫（Dugesiajaponica）

作为研究再生和神经发育的理想模式动物，具有强大的再生能力。目前研究表明泛素化

对维持涡虫整体稳态，调控细胞周期和促进再生有重要作用，但去泛素化在涡虫再生的

作用鲜有报道，USP7在涡虫中的功能仍不清楚。Cullin1是泛素连接酶复合体的骨架蛋

白，使TGF-β信号通路中Smad2/3被泛素化降解，抑制TGF-β信号通路，Tinp1是TGF-β

信号通路的下游分子，二者都与细胞周期密切相关。本研究在前期研究的基础上，从

Djcullin1RNAi和Djtinp1RNAi的转录组数据，筛选出Djusp7基因，利用RNA

interference（RNAi）、实时荧光定量PCR（qPCR）、免疫荧光、原位杂交及X射线辐

照等实验技术探究Djusp7在涡虫再生过程中的功能。实验结果如下：

(1)Djcullin1RNAi和Djtinp1RNAi的转录组数据差异表达基因前五项都与细胞膜、

核糖体、吞噬体和内质网等细胞器对蛋白质的合成转运降解过程和信号转导相关，且两

基因干扰后存在3818个相同变化的基因。

(2)Djusp7RNAi后，整体涡虫形态和神经系统没有变化；涡虫头、中、尾片段，前

端伤口可以再生头或咽，但后端伤口无法再生缺失组织，而且头片段还出现黑色条斑；

涡虫头片段和中间片段腹神经索呈现钝圆状闭合，中间片段和尾片段再生的头神经节小。

H3P免疫荧光实验统计结果显示，中间片段再生过程细胞增殖水平显著降低。TUNEL

细胞凋亡实验结果显示，再生3h中间片段细胞凋亡水平显著升高。

(3)Djusp7RNAi后，再生7d中间片段qPCR实验结果显示，眼点标记基因Djovo、

肠标记基因Djgat、细胞周期相关基因DjcyclinB表达水平显著升高，神经标记基因Djpc2

和Djchat、细胞凋亡相关基因Djcasepase8表达水平显著降低，Djcasepase3没有变化，

干细胞标记基因没有明显变化。

(4)Djusp7RNAi后，qPCR实验结果显示再生3d和7d，Wnt信号通路基因表达水

平显著降低。原位杂交结果显示再生3d，Djwnt1无法在伤口后端聚集表达，Djwnt11-2

I

表达被抑制，Djβ-catenin-1在两端芽基的表达减弱。X射线辐照消除正常涡虫干细胞后，

整体涡虫Djusp7表达水平显著升高，Djwnt1表达水平无变化，再生3d，Djusp7和Djwnt1

的表达水平显著降低，并且Djwnt1不能正常形成点状聚集信号。

(5)单独抑制Wnt信号通路不同基因（Djwnt-1、Djwnt-11-2和Djβ-catenin-1）后，

涡虫再生无尾，Djwnt1RNAi和Djwnt11-2RNAi，Djusp7的表达均显著升高，但

Djβ-catenin-1RNAi后涡虫Djusp7的表达显著降低。

(6)为进一步了解Djusp7在日本三角涡虫中的功能，检测了Djusp7RNAi后再生过

程TGF-β信号通路相关基因和高等动物USP7底物的同源基因的表达。再生5d中间片

段Djactivin、Djsmurf、Djsmad2、Djsmad4-1、Djp53、Djyki、Djpten和Djfoxo表达水平

均升高；再生7d，Djfoxo、Djpten和TGF-β信号通路基因表达水平升高。

综上所述，Djusp7在日本三角涡虫再生过程调控细胞周期，促进芽基形成、组织再

生和神经系统发育，通过调控Wnt信号通路促进身体前后轴极性的重建，Djusp7与Wnt

信号通路有复杂的联系。本研究提示去泛素化过程对涡虫再生过程位置信息重建，神经

系统发育，细胞增殖和凋亡具有重要作用，研究结果为解析USP7的功能及涡虫再生机

制提供基础数据。

关键词：日本三角涡虫，Wnt/β-catenin信号通路，涡虫再生，Djusp7

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