蛋白质的化学修饰.pptVIP

化学修饰的原理化学修饰的方法学蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链的交联亲和标记蛋白质化学修饰的应用内容提要（第九讲）三、羧基的修饰用水溶性碳二亚胺作催化剂，通过胺专一地修饰蛋白质中的羧基。++HX+碳二亚胺形成相应酰胺重排四、巯基的修饰由于半胱氨酸时蛋白质中反应性最强的残基，所以很多试剂可用来修饰巯基侧链。常用的有三类：1.碘乙酸、碘乙酰胺或环乙烯亚胺2.马来酰亚胺或马来酸酐3.有机汞试剂（一）1类试剂是烷化剂，此类试剂还能与甲硫氨酸、赖氨酸或组氨酸反应。pH﹥7碘乙酸半胱氨酸副反应：pH﹥5.5组氨酸pH=2～8.5pH=8.5甲硫氨酸（二）2类试剂能与巯基形成对酸稳定的衍生物，而与其它基团形成的产物则对酸不稳定。+pH﹥5副反应：+pH﹥7半胱氨酸（三）3类试剂对巯基专一性最强。常用的是对氯汞苯甲酸，S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸是对氯汞苯甲酸的衍生物，也可与巯基反应。马来酸酐+对氯汞苯甲酸+S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸（四）5，5′-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）也常用于修饰巯基，它与半胱氨酸形成混合二硫化物。+pH﹥6.5+DTNB2-硝基-5-硫代苯甲酸释放出的2-硝基-5-硫代苯甲酸阴离子在412nm处有吸收，可用光谱法测定其含量。五、组氨酸咪唑基的修饰常用试剂是焦碳酸二乙酯和碘乙酸。1-羧乙基组氨酸3-羧乙基组氨酸1，3-二羧乙基组氨酸+pH4～7+焦碳酸二乙酯碘乙酸用碘乙酸烷化组氨酸残基可得单取代或双取代衍生物。焦碳酸二乙酯能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化.羟胺可使反应可逆进行，回收组氨酸。+pH=7+羟胺六、色氨酸吲哚基的修饰（一）N-溴琥珀酰亚胺（NBS）常用来修饰色氨酸。它氧化吲哚基成为羟吲哚衍生物。酪氨酸也能与NBS作用。（二）各种苄基卤化物能使吲哚环烷基化最常用的是2-羟基-5-硝基苄基溴，由于溶解度的问题，常用它的类似物二甲基（2-羟基-5-硝基苄基）锍盐。应注意的问题该试剂在水介质、高pH下不稳定，迅速水解为CO2和乙醇。试剂大大过量时可与咪唑环上的两个氮都作用，形成双取代衍生物。羟胺不能使双取代物发生可逆反应，而是清除咪唑环。2-羟基-5-硝基苄基溴+pH﹤7.5+HBr醋酸++H++Cl-对氯硫硝基苯带硝基苯取代基的硫基卤化物的专一性与锍盐类似，但能产生单一产物，避免了锍盐修饰产物的不均一性，而且产物的光谱性质可用来定量测定色氨酸。七、酪氨酸酚基的修饰四硝基甲烷在温和条件下可高度专一地硝化酪氨酸残基，产生可电离的发色基团3-硝基酪氨酸。色氨酸八、甲硫氨酸甲硫基的修饰用H2O2和过甲酸可将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜，用碘乙酸烷化甲硫氨酸残基，能形成正甲硫盐。九、丝氨酸羟基的修饰甲苯磺酰氟（PMSF)可与丝氨酸残基作用。++四硝基甲烷3-硝基酪氨酸常用重要修饰剂的专一性试剂修饰的侧链LysGluCysArgSerHisTyrTrpMet醋酸酐××××酰基酸酐×××醛××××N-溴琥珀酰亚胺××××碳二亚胺×苯异硫氰××四硝基甲烷×三硝基苯磺酸×焦碳酸二乙酯××碘乙酸××××环乙烯亚胺××××甲苯磺酰氟×马来酰胺××第四节蛋白质肽链的交联双功能试剂：具有两个反应活性部位，可以在相隔较近的两个氨基酸残基间搭桥、形成多肽链内、多肽链间或者蛋白质分子之间的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。一、设计或选择交联剂要考虑的因素（一）反应的专一性交联剂分为同型双功能试剂异型双功能试剂（二）交联距离随着交联剂两个功能基之间距离跨度