组织培养基本技术.ppt

外植体的接种——是把经过表面灭菌后的植物材料在无菌环境中切割或分离出器官、组织、细胞并转入到无菌培养基上的全部操作过程。操作过程中引起的污染，主要由空气中的杂菌和工作人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防止工作人员本身引起的污染。整个接种过程均须无菌操作：010302一、外植体的接种操作人员需穿着经消毒的白色工作服，戴口罩、帽子、鞋套。进入接种室前，双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良好的效果,进行操作前再用70%的酒精擦洗双手。操作期间经常用70%的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止“双重传递”的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等。01在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大02的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管03内，解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶04口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到05足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰06尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮07盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机08会。工具用后及时消毒，避免交叉污染。工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用时在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。外植体的培养条件接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的生命活动。培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值等。01光照对离体培养物的生长发育，光照条件有重02要的作用。通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下03有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也04有不同。但分化器官需要光照，并随着芽苗的生长05需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮，06促进“异养”向“自养”转化，提高移植的成活率。普07通培养室要求每日光照12h-16h，光照强度1000lx-085000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝09箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于10暗室中培养。温度离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多数植物最适温度在23?C-32?C之间。培养室一般所用的温度是25?C±2?C。低于15?C或高于35?C，对生长都是不利的。湿度组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%。二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持70%-80%的相对湿度。氧气植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。第六节

外植体的褐变及其预防措施褐变的概念褐变的原因褐变的影响因素褐变的预防措施01030204葡萄嫩茎接种48h马铃薯茎尖接种40d一、褐变的概念logo褐变：是指外植体在培养过程中自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也进一步变褐而死亡的现象。褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物01多少和多酚氧化酶活性有直接关系。酚类很不稳02定，溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶03的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类又04会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白05质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导06致组织代谢紊乱，生长停滞不前，最终衰老死亡。07二、褐变的原因灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空间，利于蒸汽流动；增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响灭菌效果；只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；高压锅工作时，应有专人看守。排气降压时应缓慢进行；灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；高压灭菌的原理在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。