DB41T 1588-2018 饲料中沙门氏菌的检测 EMA-PCR法.docxVIP

ICS65.120B46

DB41

河南省地方标准DB41/T1588—2018

饲料中沙门氏菌的检测EMA-PCR法

2018-04-17发布2018-07-17实施

河南省质量技术监督局发布

I

DB41/T1588—2018

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由河南省畜牧局提出并归口。

本标准起草单位：河南省兽药饲料监察所、河南中标检测服务有限公司。

本标准主要起草人：张发旺、方忠意、董鹏、李金磊、李灵平、李博、于辉。

本标准参加起草人：高延玲、狄元冉、韩楠、王艳丽、贾松涛、邱天宝、邱富娜、王书丽、张跃京、张宁、王小艳、王丹。

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DB41/T1588—2018

饲料中沙门氏菌的检测EMA-PCR法

1范围

本标准规定了饲料中沙门氏菌的EMA-PCR检测方法。本标准适用于饲料中沙门氏菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T13091饲料中沙门氏菌的检测方法

GB/T14699.1饲料采样

3原理

叠氮溴化乙锭（EMA）能够透过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其DNA发生不可逆转的结合，使死细菌DNA不能作为模板进行PCR扩增，而活菌能进行PCR扩增。

4试剂和材料

4.1除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682一级水的要求。4.2缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录A的A.1。

4.3氯化镁-孔雀绿增菌液（RV）：见附录A的A.2。

4.42×PremixTaq缓冲液：内含TaqDNA聚合酶1.25U/25μL，4mmolMg2+，dNTP各0.4mmol。4.5特异性引物(对)序列为：

a）上游引物：5＇-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG-3;

b）下游引物：5＇-CATCGCACCGTCAAAGGAAC-3＇。4.6琼脂糖：电泳级。

4.7Marker2000。

4.8沙门氏菌ATCC14028。

4.950×TAE缓冲液：见附录A的A.3。4.106×上样缓冲液：见附录A的A.4。

4.11叠氮溴化乙锭（EMA，0.2mg/mL）：见附录A的A.5。

4.12溴化乙锭（10mg/mL）。

4.13灭菌离心管：1.5mL，15mL。

5仪器设备

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DB41/T1588—2018

5.1PCR仪。

5.2天平：感量0.01g。5.3电热恒温培养箱。

5.4离心机：转速≥12000r/min。5.5浊度仪。

5.6卤素灯：照度≥25000勒克斯（Lux）。5.7核酸电泳仪。

5.8凝胶成像系统。

5.9微量移液器：0.5μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL，1mL～10mL。5.10涡旋仪。

6样品采集与制备

按GB/T14699.1的规定采样，将样品充分混匀后密封低温保存，整个过程避免人为污染。

7检验步骤

7.1增菌

取25g试样于225mL缓冲蛋白胨水（4.2）中，充分混匀，36℃±1℃培养18h±2h进行预增菌，取0.1mL预增菌液转移至10mL氯化镁-孔雀绿增菌液（4.3）中，42℃±1℃培养24h±2h。如果试样量不足25g，试样质量与增菌液的体积比应为1∶9。

7.2模板的制备

取1mL增菌液至离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。加入1mL灭菌水悬浮沉淀物，12000r/min离心2min，弃上清，重复洗涤一次。加适量灭菌水悬浮沉淀物并调节菌悬液浓度至0.5麦氏单位（MCF）。取0.2mL菌悬液至离心管中，加入2μLEMA溶液（4.11）混匀，避光孵育5min。将离心管开盖置于冰上，卤素灯照射下曝光2min，然后水浴煮沸10min，再将离心管转移至冰浴中使其快速冷却。涡旋混匀裂解物，12000r/min离心2min，收集上清液，作为PCR扩增的模板（模板制备可选用等效的商品化试剂盒）。检测过程中分别设阳性对照和阴性对照，用添加沙门氏菌阳性标准菌株的样品作为阳