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ELISA1细胞内细胞因子的流式细胞仪检测2ELISPOT3免疫分析法Enzyme-linkedImmunospotAssayELISPOTELISPOT发展历史1963年:Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lyticplaqueformingcellassay,HPF),这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。1983年:Czerkinsky等成功地检测出因受刺激而分泌抗体的B细胞频率接近体内实验的环境,藉由检测T细胞分泌的各类细胞因子,来定量机体内免疫反应启始者PrecursorT亚群的大小,预测体内免疫系统即将进行的下游免疫反应。1996:俄亥俄卅CaseWesternReserve大学PaulLehmann团队引进PVDF薄膜的应用(Forsthuberetal.,Science,1996),解决了低敏感度的问题。Nordstrom等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法来提高这种方法的敏感性Herr用计算机辅助图像分析系统(computer-assistedvideoimageanalysis,CVIA)自动分析TNF-α酶联免疫斑点的大小和数量,计算与负载抗原肽的靶细胞接触后PBMC中抗原特异性CD8+T细胞的数量Vaquerano等将数码相机和计算机结合起来,开发出类似的斑点计数系统,认为当每孔斑点数大于100时,这种方法更客观、可重复性高且节省时间检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子,此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后,被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合,其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。底物孵育后,PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子,通过显微镜或ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。ELISPOT包被程序1每孔加入15μl70%的乙醇预湿30秒,PVDF膜变成半透明状(加样注意!)2加入100μl去离子水洗涤三次,尽量减少乙醇的残留3每孔加入100μl包被抗体工作液,4°C包被过夜4ELISPOT标准操作程序D1倾倒包被液,用PBS洗涤5次,最后一次,在灭菌的吸水纸上扣干200μl试剂盒自带的稀释好的封闭液,37°C封闭1小时倾倒封闭液,无须洗涤,直接可以进行细胞培养。(也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次,拍干,封口,4°C保存,可以在4°C保存数周。)ELISPOT标准操作程序D2铺细胞,加入刺激物,培养样品背景负对照(不含细胞,只加培养基和所有的检测试剂):100μl的U-Cytech无血清培养基正对照(PHA刺激)10μl,终浓度4ug/mL负对照(不加刺激物)设置2-4个孔的重复010305020406ELISPOT标准操作程序D2细胞因子检测方法基础医学院微免学系王慧娟细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指标010102疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测等02背景依赖性细胞株:生物分析法功能检测:生物分析法03免疫测定:免疫分析法04功能测定与抗体抑制05分子杂交技术:mRNA的测定06多聚酶链反应技术(PCR):mRNA的测定0102生物分析法(一)依赖性细胞株一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在体外增殖,如DTLL细胞株依赖IL-2;FDC-PL细胞株依赖于小鼠IL-3;TF-1细胞株依赖于人IL-3和人GM-CSF,因而可利用这些依赖细胞株检测相应的细胞因子。这种方法敏感性高,特异性也不错,但可异的是并非所有细胞因都能找到相应的细胞株,因而限制了它的应用。(二)功能检测利用一些细胞因子的功能特性,可建立相应的活性测定方法,如干扰素的抑制病毒感染效应,肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。这样的方法敏感性高,但特异性不够,容易受一些扰因素的影响。酶联免疫吸附实验(ELISA)02放免实验(RIA)01免疫分析法mRNA的测定(1)分子杂交实验(2)逆转录PCR(RT-PCR)生物学检测法比较敏感,又可直接测定生物学功能,是最可靠的方法,适用于各种实验目的,是科研部门最常用的技术,但需要长期培养依赖性细胞株,检测耗时长,步骤繁杂,影响因素多,不容易熟练掌握。01免疫学检测法比较简单,迅速,重复性好,但所测定的只代表相应细胞因子的量而不代表活性,同时敏感度也低于生物活性检测法(约低10~100倍)。02分子生物学法只能检测基因表达情况,不能直接提供有关因子的浓度及活性等资料,主要用于机制探讨。03小结标准化生物
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