组织化学技术教程.ppt

第三章组织化学的基本技术01织化学发展到今天，它的技术多而复杂，但基本技术是容易掌握的。从样品的取材、固定剂的选择、切片的制备、孵育反应、各种溶液的配制以及光镜组织化学技术和电镜组织化学技术等，每项技术都有明确的要求和规范的操作程序。进行没项工作，应事先做好准备，按技术程序进行，可做一定的预备实验，效果稳定后，再开始实验研究，这样才能达到预期的科研效果。02?一、????样品的取材样品制备的第一步就是取材，取材的好坏关系到实验的结果。所以必须做好准备工作。如取材的器材；动物标本准备，一般轻微麻醉，迅速取材为好。现将取材的原则和具体要求分述如下：⑴??刀剪锐利、洁净。⑵快速、准确、尽量保持生活状态，力争1分钟之内放入固定液，最迟不能超过3分钟。要清楚取材的部位和内部，对病理组织还应做到以下几点：①???材部位必须是主要病变区。②必须取病灶与正常组织的交界区③必要时取远离病灶的正常组织做对照。⑶一刀切取，切取应在蜡版或滤纸上进行，避免拉锯、牵拉或挤压等动作。⑷低温操作，防止自溶现象，通常以0℃-4℃的低温条件下操作为佳。⑸定位准确，取材时必须注意样品的定向和定位，即头、尾、左、右以及上、下方向。切好的样品贴放在滤纸片上，标记好定向标志，防入预冷固定液内，或冰冻切片或短时间冷冻保存。⑹样品大小适当，光镜样品一般在1.0cm以内，免疫组织化学样品大约在:2cm×1.5cm×0.3cm[厚度控制在0.3cm]。cm3小块。固定定的目的要求固定是将组织尽可能保持原有生活状态以适用于某些研究程序的一种方法。固定有如下几方面的目的。不仅保持组织生前的形态结构，还要保持结构的化学成分和活性。促使组织凝固、硬化，保持一定的形状、体积。增加媒染作用，便于染色；增加折光率，便于观察。杀死活细胞或活组织，以进行组织化学反01应。由于固定的上述目的要求，许多良好02的组织学固定液，却不能用于组织化学标03本，特别是酶组织化学标本和免疫组织化04学标本。05固定剂的选择06用于组织化学的固定剂有很多种，一07般可分为单纯固定剂和混合固定剂两大类。08所有的组织化学标本固定必须根据其性质及09所进行的组织化学反应选择适当的固定剂。10常用组织化学固定剂举例如下：⑴醛类固定剂：甲醛、戊二醛；中性福尔马林，多聚甲醛等。⑵非醛类：丙酮、酒精、Zenker’s液和Carnoy氏液等等。应用固定剂时应查阅有关的文献资料，对前人未做的方法应慎用。固定剂穿透组织的速率有很大特异性，不同的固定液其穿透组织速率可有明显的不同（穿透因子不同）：t=k·de[t=时间；d=组织深度；k、e为穿透因子（常数）]浸透固定法是将组织块浸泡在固定液内而固定的一种方法。在组织化学样品的处理上，对浸透的时间、温度有一定的要求，特别是免疫组织化学样品的要求更严一些。04固定法05固定的方法01原位固定法是在保持动物对其器官组织血液供应的条件下，边解剖边向所取样本的部位滴加预冷的固定液的一种方法。这种方法有益于组织细胞酶活性和结构的保存，不足之处是对动物刺激时间较长，因此应快速取样，断头处死动物。03原位固定法02灌流故定法灌流故定法是通过血管的途径，将固定液灌注到所要固定的器官组织内，将生活的细胞在原位及时的固定后，在摘取样品的方法。这种方法的特点是：快速、固定充分，但是对固定液的温度、压力及取材时间有严格的要求。培养细胞和外周血细胞固定法培养细胞核外周血细胞的固定方法比较特殊，对培养细胞通常取盖片入37℃的Hanks液中，漂洗两次(每次3—5min)，洗除血清后，再置于甲醛缓冲固定液内10—30min。.如果进行电镜观察就以2%戊二醛固定或采取双重固定法。外周血通常采用涂片，以甲醛缓冲固定液固定。电镜酶组化则须离心沉淀后，用戊二醛固定（具体法见第4，5，6章）。固定后的处理——漂洗已固定的组织样品，在切片之前必须进行漂洗，其主要目的是洗去组织中存余的固定液。这样做有助于酶活性的提高，可避免样品下一步和其它液相的液体接触，引起组织的结构改变和酶活性的降低，漂洗要求最适的PH值、渗透压、温度和时间来进行,否则会影响试验的结果。一般的组织化学染色切片厚度要求在5～7μm左右，神经组织切片的厚度要求比较特殊