质粒的提取和电泳.ppt

****先介绍一下实验步骤和注意事项。离心机由学生操作。*置-20℃沉淀15-30min放映：温度控制系统。*提完质粒午休*重组质粒的酶切加样：20分钟（8：15~8：35）；酶切45分钟（8：35~9：20）*电泳上样：20分钟（9：20~9：40）；电泳时间：40分钟（9：40~10：20）观察昨天实验课的结果培养板在37C培养12-16h卫星菌：培养时间过长1、观察自己组的实验结果：转化平板制备效率高的感受态细胞2、实验中的难点重组质粒的鉴定提取的质粒重组质粒的进一步酶切鉴定质粒电泳筛选重组质粒平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞如何鉴定平板上的菌落为含有重组质粒的菌落？重组质粒的进一步酶切鉴定提取的质粒平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞质粒电泳筛选重组质粒小量制备质粒和电泳分析质粒……01质粒载体02是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状03筛选标记MCS（多克隆位点）复制原点04质粒051)培养细菌使质粒扩增；2)收集裂解细菌；3)分离纯化质粒DNA。质粒提取原理：质粒提取有多种方法，但都包含有3个基本步骤：√去除蛋白质√去除基因组DNA√去除RNA*酚-氯仿抽提法*RNase消化？？？质粒DNA与基因组DNA的区别1、部位不同：单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。您的内容已经简明扼要，字字珠玑，但信息却千丝万缕、错综复杂，需要用更多的文字来表述；但请您尽可能提炼思想的精髓，否则容易造成观者的阅读压力，适得其反。2、大小不同：大肠杆菌遗传物质质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一。基因组DNA分子量较大，细菌基因组约含3000个基因，5?106bp。基因组DNA容易断裂线性化提取的质粒的方法：特点：小量质粒制备、最简便、快捷应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）测序、转染（细提）1.小量碱裂解法01纯化原理：离子交换柱层析等去除内毒素制备质粒kit质粒提取试剂盒可用于大部分分生实验，本次试验不进行实验操作，只讲解结果分析。2.质粒提取试剂盒02小量制备质粒kit大量制备质粒kit碱裂解法提取质粒的原理原理：1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱性条件下发生变性。2、怎样去除基因组DNA？当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；3、怎样去除蛋白质？（已经学过）留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后,用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA.1)细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.HclPH8.010mmol/LEDTA.Na2PH8.02)细菌裂解液（溶液II）--裂解菌体0.2mol/LNaOH1%SDS碱裂解法提取质粒试剂：质粒DNA的制备ml5mol/L醋酸钾5ml冰醋酸5ml水3）中和液（溶液III）----中和NaOH01工作浓度30～50?g/ml其他试剂作用和成分同实验一。4）20mg/mlRNase----降解细菌RNA02（1）（细菌的收获：）取1.5ml工程菌液6,000转/分，离心2min，弃上清。（2）（细菌的裂解：）加入200?l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌加入200?l细菌裂解液（溶液II），颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。注：粘稠：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。（3）（中和：）加入150?l中和液，上下颠倒混合后置冰上5min，12,000转/分，4℃离心5min。