酶的提取和分离纯化.ppt

起始缓冲液的pH通常应高于所需pH约0.4个单位，这样可以缓和起始缓冲液与洗脱缓冲液想到作用产生的pH波动影响。01洗脱液和体积和洗脱强度有关。推荐相当于３个pH单位间隔的10倍床体积。02洗脱液流速和要达到的分辨程度有关，可控制在30~40ml/h。035.洗脱聚焦效应聚焦色谱过程01在收集的各洗脱液组分，除了含有蛋白质外，也包含多缓冲液，后者虽不干扰酶的检测，但它可能络合某些金属离子如铜等，因而最好在洗脱后设法将它们除去。02比较简单的办法是将固体硫酸铵加入相应的洗脱液组分中，使之达到80%-90%饱和度，放置1-2h后让蛋白质完全沉淀，再离心分出。6.多缓冲液和蛋白质组分的分离7.交换剂的再生与贮存交换剂用完后可直接用其所长2-3倍床体积的1mol/LNaCl流洗色谱柱，以除去吸附在上面的蛋白质，进行再生。如果还有结合力较强的蛋白质，则可用0.1mol/LHCl洗除，但此时必须立即用高pH的溶液中和，并再用适宜pH的起始缓冲液平衡。多缓冲液和多缓冲交换剂一般可贮于4℃左右的暗处。再生的交换剂可加24%的乙醇防止微生物污染。5.4利用专一亲和作用进行的纯化1亲和色谱法亲和电泳法融合蛋白亲和分离法其他相关的亲和分离法2原理：这是利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离的技术。01在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液（流动相）中的另一分子作亲和色谱。02一、亲和色谱作为固定相的一方称为配基（ligand)，配基必须偶联于不溶性的母体上，母体又称为载体或担体。对于酶的分离，配基可以是它的底物、辅助因子、底物类似物或竞争性抑制剂，通常它们都具有较高的亲和力，能专一而可逆地形成酶-配基络合物，亲和关系愈专一，分离效果愈佳。常见的有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃载体(matrix)偶联（coupling）载体本身没有活性基团，要先将载体活化；为了改善亲和吸附的效果，采用小分子物质作为配基时，可引入连接臂（spacearm），以减少载体的空间位阻。（一）亲和色谱剂亲和色谱剂01原理：利用膜的借助于一定孔径的各种高分子薄膜，将不同大小、不同性状和不同特性的物质颗粒或分子分离的技术，统称为膜分离技术。02超滤：具有分子筛效应，能用于酶等大分子物质的分离、浓缩、纯化，操作简单，条件温和，但只能达到粗分的要求，且不适于需要小分子辅酶的酶。03操作压力：50~700kPa，超滤膜截留的颗粒直径2~200nm，相当于分子量1~500kD。二、膜分离技术膜分离技术透析离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术。在酶的提取和分离纯化过程中，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分离。超速离心机的最大转速达25000~80000r/min，最大相对离心力达500000g，甚至更高。超离心法只能处理小体积的试样，主要用于病毒、细胞颗粒等的制备，对分子量较小的酶或蛋白质分离效果一般不佳。123三、离心11.5.3根据电学解离性质不同进行的纯化1吸附色谱法2电泳分离法3聚焦色谱4快速液相色谱5疏水色谱这也是最常用的一类纯化方法。这是利用样品中待纯化分子和杂质分子与吸附剂间吸附能力与解吸性质不同而建立的分离纯化方法。这类方法或以静态方式进行，或以色谱方式进行。对于后者，混合物随流动相通过由吸附剂组成的固定相时由于吸附剂对不同物质的不同吸附力而使混合物分离。不管用哪种方式，都包括三个基本环节：加样吸附、洗涤和洗脱。12一、吸附交换（色谱）01根据吸附机制不同，吸附剂可分为三种类型：物理吸附剂、羟基磷灰石吸附剂和离子交换吸附剂。传统的物理吸附剂常用的有白土、氧化铝和磷酸钙02吸附色谱吸附色谱负吸附：从混杂的酶蛋白溶液中吸去不需要的杂蛋白。正吸附：吸附所需要的蛋白质影响吸附、洗脱的的主要因素：pH正吸附在较低的pH下进行负吸附可在较高的pH及离子强度下进行离子强度低盐浓度有利于吸附蛋白质浓度1%以减少蛋白质间的相互作用，利于吸附。吸附剂与蛋白质比例蛋白质/吸附剂=0.5~10(w/w)2.羟基磷灰石吸附羟基磷灰石柱色谱常用以分离凝胶色谱或离子交换色谱所不能分离的酶蛋白。3.离子交换色谱这是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异而予以分离的技术，包括吸附、吸收、穿透、扩散