槲皮素增强氟苯尼考对嗜水气单胞菌杀菌作用的机制研究.pdf

摘要

嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）广泛分布在各种水环境中，是引起鱼类运动

性气单胞菌败血症（motileAeromonassepticemia，MAS）的主要病原体，给水产养殖业

造成巨大的经济损失。近年来，由于抗菌药物滥用现象严重，导致水产病原菌的耐药性

越来越强，并且多数细菌表现出多重耐药的现象。同时，渔业中过量使用的抗菌药物进

入周围水体环境，可能对人类健康造成威胁。面对这一问题，农业农村部部署实施了水

产绿色健康养殖“五大行动”，开展水产养殖用药减量行动，推进实施水产绿色健康养

殖。因此，降低抗菌药物使用量，提高对耐药致病菌的防控能力已经刻不容缓。

近年来，中草药联合抗菌药物用药，被广泛应用于水产动物病害防治中。槲皮素作

为一种中草药中的黄酮类化合物，其药理作用广、副作用小、生物活性强，拥有良好的

应用前景。因此，本课题组使用槲皮素与抗菌药物对嗜水气单胞菌进行协同杀菌，采用

药物联合抑制指数、抗菌药物的杀菌效率、细菌生长曲线、组织细菌的清除和鱼体存活

率等方法研究联合槲皮素与氟苯尼考用药对嗜水气单胞菌的体内外杀菌作用。进一步鉴

定槲皮素的作用靶点，研究槲皮素增强氟苯尼考对嗜水气单胞菌杀菌作用的分子机制。

所获研究结果如下：

1.槲皮素与氟苯尼考协同杀菌作用

本实验使用嗜水气单胞菌ATCC7966，通过抗菌药物与槲皮素联合杀菌的方法，筛

选出有协同效果的11种抗菌药物，其中槲皮素与氟苯尼考协同作用最为显著。因此，

选择氟苯尼考与槲皮素作为研究对象，通过药物联合抑制指数和药物剂量的优化，研究

氟苯尼考与槲皮素联合用药对嗜水气单胞菌的杀菌作用。结果发现，氟苯尼考与槲皮素

联合用药的部分抑菌指数为0.28，显示出协同作用。体外的杀菌结果显示，槲皮素与氟

苯尼考联合使用比单独使用氟苯尼考对嗜水气单胞菌的杀菌作用要高16.3-191.4倍；槲

皮素剂量优化结果表明，60μg/mL槲皮素与氟苯尼考具有最高的杀菌作用；同时还发现，

槲皮素与氟苯尼考联合用药的杀菌作用具有时间依赖效应，作用时间越长杀菌作用越明

显。体内的杀菌结果显示，与单独使用槲皮素或氟苯尼考相比，槲皮素与氟苯尼考联合

用药显著降低鱼体肾脏、肝脏和脾脏中的细菌载量，最高达610.6倍；鱼体存活率从对

照组的10%增加到联合用药组的90%。这些结果表明，槲皮素具有增强氟苯尼考对嗜水

气单胞菌抗菌活性的作用，因此可显著降低抗菌药物的使用量。

2.槲皮素作用靶点鉴定

研究槲皮素增强氟苯尼考对嗜水气单胞菌杀菌作用的机制，首先要确定槲皮素对嗜

水气单胞菌作用的靶点。本实验通过亲和层析的方法鉴定槲皮素与嗜水气单胞菌外膜蛋

白相互作用的靶点蛋白，通过SDS电泳发现一条特异性的条带，通过质谱鉴定结

果并制备抗体进行Western-Blot验证，发现LamB蛋白可能是槲皮素与嗜水气单胞菌外

膜蛋白相互作用的靶点蛋白。

3.嗜水气单胞菌外膜蛋白lamB的基因克隆及抗体制备

为了探究槲皮素对嗜水气单胞菌LamB蛋白的调节作用及功能，本实验克隆了lamB

基因，并制备了多克隆抗体。结果表明，lamB基因包含一个1380bp的开放阅读框，编

码459个氨基酸，预测蛋白分子量为48.5kDa。结构预测发现，LamB蛋白结构由三个

单体形成三聚体，可以形成物质运输的通道。随后，本实验构建了lamB原核表达载体，

成功表达出rLamB蛋白并制备了鼠源多克隆抗体。ELISA结果表明，制备的LamB抗

体效价高达1：90,000。Westernblot结果表明制备的抗体可特异性识别LamB蛋白。

4.槲皮素增强氟苯尼考对嗜水气单胞菌杀菌作用的分子机制

通过氟苯尼考选择压力，人工诱导氟苯尼考耐药菌的产生。qRT-PCR结果发现，随

着氟苯尼考耐药倍数的增加，lamB基因的表达显著下调，而槲皮素或槲皮素与氟苯尼

考联合作用后，lamB基因的表达显著增加。这些结果表明槲皮素可能通过调节lamB基

因的表达发挥作用。

为了进一步探究槲皮素调控lamB基因表达的分子机制，本实验针对lamB基因构建

了缺失菌株与过表达菌株。通过检测缺失菌株与过表达菌株对氟苯尼考的耐药性，发现

lamB基因在过表达后细菌对氟苯尼考耐药性减弱；而lamB基因缺失后细菌对氟苯尼考

的耐药性增强，同时槲皮素失去了增强氟苯尼考对嗜水气单胞