利用多酶环状级联策略生产β-烟酰胺单核苷酸.pdf

摘要

烟酰胺单核苷酸(Nicotinamidemononucleotide，NMN)是人体内合成NAD+的

重要前体。它与多种疾病密切相关，已逐渐应用于保健食品和医药领域，但是以

NMN为主要成分的产品仍然非常昂贵。与化学合成NMN相比，生物法由于无

有机溶剂残留、无手性问题，成为最环保的合成方法。但仍有制约因素，包括高

效率酶制剂的缺乏、不同酶反应间难以协同、反应底物带来的高昂成本等问题。

本研究以合成NMN为目标，选择合适底物，分别构建了能够表达5-磷酸核

苷酶(PpnN)、磷酸核糖焦磷酸激酶(Prs)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的重组菌

株，对其活性和协同表达进行诱导和优化。通过高效液相色谱、质谱、傅里叶红

外光谱进行产物鉴定，然后对反应条件进行优化，结果表明，多酶环状级联反应

的最适温度为50℃，最适pH是8.0-8.5，最佳取样时间是3小时，三种酶的最佳

比例是1：8：8，底物NAM：ATP的最佳比例是1.75：1。同时，对级联反应的

限速酶Nampt的酶学性质进行分析，探究了它的最适反应温度，最适pH以及热

稳定性。

对构建的高水平表达重组菌株进行了细胞固定化，用于制备NMN，通过海

藻酸钙、琼脂、琼脂糖、明胶和卡拉胶等固定化载体的比较，发现琼脂为一种比

较适宜的固定化载体，当琼脂浓度为3%，包埋菌体量为0.2g/mL时，NMN最

高生成量为1.97g/L。

利用分子对接的方法分析Nampt与小分子NAM、PRPP、ATP、ADP的对接

“口袋”，确定了9个氨基酸位点，获得9个突变体。检测结果显示有5个催化活

性提高的突变体SER250、ARG311、ASP366、GLY395、ALA410，其中突变体

GLY395产量达到2.51g/L。

关键词：烟酰胺单核苷酸，多酶环状级联反应，固定化细胞，定点突变

ABSTRACT

NicotinamidemononucleotideisanimportantprecursorofNAD+synthesisinhumanbody.It

iscloselyrelatedtomanydiseasesandhasbeengraduallyappliedtohealthfoodandmedical

medicine.However,productswithNMNasthemaincomponentarestillveryexpensive.Compared

tothechemicalsynthesisofNMN,thebiologicalmethodhasbecomethemostenvironmentally

friendlymethodbecauseithasnoresidualorganicsolventandnochiralissues.However,some

limitationsremain,suchasalackofeffectiveenzymepreparation,duetotheasynergyofmany

differentenzymaticcatalyticreactions,andthehighcostofthereactionsubstrateandsoon.

Inthisstudy,withtheaimofsynthesizingNMNandselectingsuitablesubstrates,we

constructedstrainscapableofexpressing5-phosphonucleosidase(PpnN),phosphoribosyl

pyrophosphatekinase(Prs)andnicotinamidephosphoribosyltransferase(Nampt),respectively,and

optimizedtheiractivityandexpress