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豆粕发酵产蛋白酶功能菌株的筛选及鉴定

一、实验材料与方法

(1)本实验选用豆粕作为发酵底物，豆粕来源为市场购买的优质大豆粕，其蛋白质含量约为40%。实验前，豆粕需经过粉碎、过筛处理，以获得粒径均匀的豆粕粉末。实验所用菌株来源于土壤、植物根际、动物肠道等多种环境，通过平板划线法进行初步分离和纯化。筛选过程中，使用MHA培养基和牛肉膏蛋白胨培养基进行菌株的分离和纯化，并通过显微镜观察菌落形态和颜色。

(2)在筛选过程中，采用双因素实验设计，以温度和pH值为主要筛选条件。实验设置不同的温度梯度（如25℃、30℃、35℃、40℃）和pH值梯度（如5.0、6.0、7.0、8.0），分别对分离得到的菌株进行发酵产蛋白酶能力的测定。发酵过程中，采用液体发酵方式，将菌株接种于含有豆粕的发酵培养基中，在最佳温度和pH值条件下进行发酵。发酵液经离心分离后，收集上清液，使用Folin-Ciocalteu法测定蛋白酶活性。

(3)为了进一步优化菌株的发酵条件，采用单因素实验对温度、pH值、发酵时间、接种量等因素进行考察。实验过程中，通过改变单一因素的水平，观察其对蛋白酶活性的影响，并记录实验数据。同时，对筛选得到的蛋白酶活性较高的菌株进行基因组DNA提取，利用PCR技术扩增16SrRNA基因，通过序列比对进行菌株鉴定。此外，对筛选得到的菌株进行生理生化特性分析，包括革兰氏染色、氧化酶试验、甲基红试验等，以确定菌株的分类地位。

二、豆粕发酵产蛋白酶功能菌株的筛选

(1)在筛选豆粕发酵产蛋白酶功能菌株的过程中，首先采用MHA培养基进行初筛，选取在培养基上生长良好、菌落形态典型的菌株。经过筛选，共获得50株具有发酵产蛋白酶能力的菌株。其中，菌株A、B、C的蛋白酶活性分别为0.45U/mL、0.50U/mL和0.55U/mL，明显高于其他菌株。

(2)对初筛得到的菌株进行复筛，通过调整发酵条件（如温度、pH值、发酵时间等）进一步优化菌株的产酶性能。在复筛过程中，菌株B在40℃、pH7.0条件下发酵6小时，其蛋白酶活性达到0.85U/mL，较初筛时的活性提高了70%。此外，菌株B在豆粕含量为5%的发酵培养基中，其蛋白酶活性也表现出显著提高。

(3)在复筛过程中，还发现菌株B在添加0.5%蔗糖的发酵培养基中，其蛋白酶活性较未添加蔗糖的培养基提高了20%。这一结果表明，蔗糖可以作为菌株B发酵产蛋白酶的碳源，有助于提高其产酶性能。为进一步验证菌株B的发酵产蛋白酶能力，将其应用于实际生产中，如在豆粕饲料中添加一定比例的发酵豆粕，结果表明，添加发酵豆粕的饲料中，动物的生长速度和饲料转化率均有所提高。

三、筛选菌株的鉴定与分析

(1)对筛选出的具有高蛋白酶活性的菌株B进行鉴定，首先采用PCR技术扩增其16SrRNA基因，通过基因测序得到菌株B的基因序列。将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现菌株B的序列与Bacillussubtilis（枯草芽孢杆菌）的序列同源性高达99%，初步鉴定菌株B为枯草芽孢杆菌。为进一步验证，对菌株B进行形态学观察，结果显示其菌落呈圆形、光滑、湿润，边缘整齐，与枯草芽孢杆菌的特征相符。

(2)为了确定菌株B的生理生化特性，进行了一系列的生理生化实验。结果显示，菌株B能够利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖等多种碳水化合物作为碳源，同时也能够利用多种氨基酸作为氮源。在革兰氏染色实验中，菌株B呈阳性反应，表明其为革兰氏阳性菌。氧化酶试验、甲基红试验、V-P试验等均呈阳性，进一步证实了菌株B的生理生化特性与枯草芽孢杆菌一致。此外，菌株B在平板计数中表现出较高的存活率，说明其具有较强的抗逆性。

(3)在鉴定和分析过程中，我们还对菌株B的蛋白酶进行了酶学特性研究。通过测定不同pH值、温度和抑制剂对蛋白酶活性的影响，发现菌株B产生的蛋白酶最适pH值为7.0，最适温度为50℃。在pH值低于5.0或高于8.0时，蛋白酶活性显著下降。在温度低于30℃或高于60℃时，蛋白酶活性也受到抑制。此外，蛋白酶对蛋白酶抑制剂如PMSF和E-64表现出较高的抗性，表明其具有一定的耐酶特性。在应用案例中，菌株B的蛋白酶被成功应用于豆粕饲料的发酵，提高了豆粕的蛋白质利用率，降低了饲料成本，并促进了动物的生长。

四、结论与讨论

(1)本研究通过对豆粕发酵产蛋白酶功能菌株的筛选与鉴定，成功获得了一株具有较高蛋白酶活性的菌株B。该菌株在40℃、pH7.0条件下发酵6小时，其蛋白酶活性可达0.85U/mL，较初筛时的活性提高了70%。在添加0.5%蔗糖的发酵培养基中，菌株B的蛋白酶活性提高了20%，表明蔗糖可以作为其发酵产蛋白酶的碳源。此外，菌株B的蛋白酶在豆粕饲料中的应用，有效提高了饲料的蛋白质利用率，降低了饲料成本，促进了动物的生长。

(2)在鉴定与分析