微生物发酵漆酶蛋白初步分离与制备实验过程记录.docx

AHPU-BioSection

生物工程专业

《生物分离工程综合实验》

2023—2024第2学期

专业班级：

学生姓名：

学号：

指导教师：

完成日期：

实验过程记录

第一天

一、实验目的:

今天实验的目的是对漆酶原液进行预处理，除去可能含有的菌丝体、培养基残渣等不溶物，获上清液并同时对上清液的酶活力以及蛋白质浓度进行测定，掌握漆酶活力，蛋白含量的测定方法和原理，同时为后续实验奠定基础，提高我们对生命科学知识的理解和应用能力。

二、实验原理：

1.漆酶酶活的测定：不同的漆酶活力测定底物，在漆酶催化作用下形成不同的底物自由基（一般伴随着颜色反应），在适当浓度范围内，漆酶活力测定体系中底物自由基浓度与特征波长下的OD值成正比，从而计算出酶活力大小。根据测定漆酶活力底物种类的不同，常用的酶活测定方法有ABTS法、DMP法、愈创木酚法和丁香醛连氮法等。本实验室采用愈创木酚为底物进行漆酶活力的测定。

②方法以愈创木酚为底物，3mL反应混合液中，含50mmol/L琥珀酸钠缓冲液（pH=4.5），1mmol/L底物和0.6mL适当稀释的酶液，30℃水浴保温反应30min后，于465nm处测定吸光度。以酶液事先灭活的反应混合液为对照，酶活定义：以1min内催化氧化1μmol愈创木酚的量为1个酶活单位（U）。

；其中??=1.2×104L/mol·cm；△OD：30min内吸光度的变化值；△t：30min；Vt：酶反应液的总体积；Ve：酶反应液中酶液体积。试验重复3次，取平均值。

样品可能要适当稀释，否则活力较高，反应较快，计算不方便且吸光值很容

易超出范围，误差较大。

2.蛋白质含量的测定：考马斯亮蓝G250比色法，也被称为Bradford法，是常用的一种蛋白质浓度的测定方法。具体测定方式是：以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白，以OD59值为纵坐标，蛋白质含量(μg）为横坐标，绘制出蛋白质标准曲线。根据国际理论应用化学协会推荐的方法，考马斯亮蓝G250能与蛋白质通过范德华力相互作用形成蛋白质-考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生位移，在595nm处有最大吸收值，并且在低浓度范围（0.01~1.0mg/mL）内，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律，其溶液颜色用分光光度计（595nm处）测得OD595值，然后借助于标准曲线计算出蛋白质的含量。

三、实验材料与设备：

今天的实验所需材料和设备如下：

1.变色栓菌漆酶发酵液：用于漆酶蛋白的初步分离和提取。

2.愈创木酚：用作漆酶底物，对漆酶蛋白活力进行测定。

3.磷酸盐缓冲液（pH=7.2）：用于酶催化反应缓冲液、底物溶解液、样品稀释液。

4.考马斯亮蓝G250：与蛋白质特异性结合并显色，用于测定蛋白质浓度。

5.试管、离心管、高速离心机、烧杯、量筒、玻璃棒、比色皿、紫外分光光度计、数显恒温水浴锅等常规实验器具。

四、实验内容：

1.实验预处理（所得上清液S1）：

本次实验3个人为一组，取20mL漆酶发酵液用离心机在4000rpm的转速下离心15min（或在8000rpm的转速下离心5min），收集上清液，并测量所得到的上清液的体积、酶活和蛋白含量，在测定酶活力和蛋白质含量时可能需要适当稀释，可经过预实验估算稀释倍数。

2.漆酶活力的测定：

以愈创木酚为底物，3mL反应混合液中，含50mmol/L琥珀酸钠缓冲液（pH=4.5），1mmol/L底物和0.6mL适当稀释的酶液。事先取S1酶液进行灭活，再按上述同样步骤配置成反应混合液，作为对照组。对照组和实验组共同于30℃水浴保温反应30min后，于465nm处测定吸光度。

3.蛋白质含量的测定：

①取7支试管，按下表加入试剂，将试管摇匀，放置20分钟，用分光光度计比色测定吸光值A595nm。以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

试管编号

0

1

2

3

4

5

6

蛋白标准溶液

【0.5mg/mL】

牛血清白蛋白（mL）

0

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1

蒸馏水（mL）

1

0.9

0.8

0.6

0.4

0.2

0

考马斯亮蓝（mL）

5

5

5

5

5

5

5

OD595nm

表SEQ表\*ARABIC1标准曲线试剂添加配料

②取粗酶液（S1）0.2mL，蒸馏水0.8mL，考马斯亮蓝5mL,用分光光度计比色测定吸光值A595nm，然后借助于标准曲线计算出蛋白质的含量。

五、实验结果：

1.粗酶液体积VS1=15mL；

2.对于粗酶液S1进行酶活的测定，于465nm处测定吸光度