牛β-酪蛋白标准品中 A1、A2 含量的测定方法.pdfVIP

牛β-酪蛋白标准品中A1、A2含量的测定方法

A.1试剂

A.1.1乙腈：色谱纯。

A.1.2三氟乙酸：色谱纯。

A.1.3盐酸胍：分析纯。

A.1.4二硫苏糖醇：分析纯。

A.1.5二水合柠檬酸三钠：分析纯。

A.1.6三羟甲基氨基甲烷（Tris）：分析纯。

A.1.7盐酸：分析纯。

A.1.8氯化钠：分析纯。

A.1.9Tris-HCl缓冲液：称取1.211g三羟甲基氨基甲烷，用8mL水溶解后用盐酸调节pH

至8.5后，转移至10mL容量瓶中，用水定容至刻度。也可直接采用商业化试剂。

A.1.10TBS溶液：称取0.9g氯化钠，用10mL水溶解后转移至100mL容量瓶中；将Tris-HCl

缓冲液全量全量转移至该容量瓶中，用水定容至刻度。也可直接采用商业化试剂。

A.1.11牛β-酪蛋白标准品。

A.1.12牛A1β-酪蛋白储备液(400μg/mL)：取适量纯化牛A1β-酪蛋白，加入50μLTBS溶液

(pH=8.5)，溶解混匀。于-20℃保存。可保存使用6个月。

A.1.13牛A2β-酪蛋白储备液(400μg/mL)：取适量纯化牛A2β-酪蛋白，加入50μLTBS溶液

(pH=8.5)，溶解混匀。于-20℃保存。可保存使用6个月。

A.1.14缓冲试剂：分别称取盐酸胍5.732g，二硫苏糖醇0.309g，二水合柠檬酸三钠0.147g

于10mL容量瓶中，用水定容，混匀。

A.1.15流动相A：量取1mL三氟乙酸，用水定容至1L。

A.1.16流动相B：量取1mL三氟乙酸，用80%乙腈-水溶液定容至1L。

A.2标准溶液配制

A.2.1β-酪蛋白标准储液（100mg/mL）：准确称取100mgβ-酪蛋白标准品（精确至0.1mg）,

用缓冲试剂定容至1mL。

A.2.2β-酪蛋白中间液（1mg/mL）：量取β-酪蛋白标准储液10μL,用缓冲试剂定容至1mL。

A.2.3β-酪蛋白测定液（20μg/mL）：量取β-酪蛋白中间液10μL,用缓冲试剂定容至1mL。

A.2.4A1β-酪蛋白中间液（20μg/mL）：取牛A1β-酪蛋白储备液50μL，用缓冲试剂定容至1mL。

A.2.5A1β-酪蛋白工作液（10μg/mL）：取牛A1β-酪蛋白中间液250μL，加入250μL缓冲试

剂。

A.2.6A2β-酪蛋白中间液（20μg/mL）：取牛A1β-酪蛋白储备液50μL，用缓冲试剂定容至1mL。

A.2.7A2β-酪蛋白工作液（10μg/mL）：取牛A2β-酪蛋白中间液250μL，加入250μL缓冲试

剂。

A.3仪器和设备

T/CITS0012—2022

A.3.1高效液相色谱仪：高灵敏紫外检测器。

A.3.2涡旋混合器。

A.4参考色谱条件

A.4.1色谱柱：DiscoverBIOWidePoreC18-5(250mm×4.6mm，5μm)或等效色谱柱。

A.4.2柱温：50℃

A.4.3检测波长：215nm。

A.4.4流速：0.8mL/min。

A.4.5进样量：50μL

A.4.6梯度洗脱，参考洗脱条件见表A.1

表A.1参考洗脱条件

时间/min流动相A/%流动相B/%

03565

73565

175050

285545

356238

369010

609010

70