流式细胞仪简介和使用方法.pptVIP

流式细胞仪标本处理一般原那么及方法;第一局部;标本来源：

外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。;标本处理时间：;样本处理标准试剂：;二、0.1%BSA-PBS缓冲液;方法一：溶血法;注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸为主的溶血剂〔CoulterQ-Prep〕，基于NH4CL的BD公司的FACSLyse溶血剂。;方法二：密度离心法提取单个核细胞;1.准备2ml抗凝血〔根据实验要求确定用血量〕，

等量PBS稀释；;淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松散，容易别离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤便可。;其他标本：通常在其他组织中别离淋巴细胞需用酶进行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。;方法：;其他类型细胞;材料

;将样本置于皮氏培养皿，加15mlBSA-PBS，将样本切成1mm3大小，用镊子将其别离；

HBSS或PBS洗清

参加10ml无Ca??Mg离子0.2%II型胶原酶溶液0.02%DNase1的HBSS；

37oC摇床上孵育15~60分钟，视样本类型而定；;用5ml的吸样管反复吹打，制成单个细胞悬液；

使用35um滤网过滤，300g离心5分钟；

用PBS或细胞培养液重悬样本；对于某些样本过滤后仍有小块组织，重复第5步获取细胞，重复第7步；

用含0.15%胰酶、0.02%DNase1不含Ca、Mg的HBSS重悬，37oC孵育一段时间参加1%BSA或5%FBS，灭活酶活性。;细胞培养;样本处理;抗体染色一般方法;细胞计数方法;反响体积;抗体染色;SPECIFIC

ANTIBODY;流式细胞仪抗体滴定方法;6;孵育、溶血、固定;;白细胞保护型溶血剂Cal-Lyse(其中已含细胞固定剂)：;各溶血剂性能比较;;;抗体标记荧光素及其他荧光染料;标记抗体常用荧光素FITC;PE;PE-Cy5TC;PE-Cy7;APC;核酸染料;细胞膜电位、离子、脂类探针;与流式细胞仪相关的荧光术语;第二局部;上机检测;技巧一：定位目标细胞群体;技巧二：阴性对照;技巧三：常见故障及解决;技巧四：检测指标;荧光补偿：极其重要的操作;FITC与PE;调与未调补偿;补偿调节原理;补偿调节原理;双色荧光补偿调节标准方法：第一步;双色荧光补偿调节标准方法：第二步;双色荧光补偿调节标准方法：第三步;因为：;所以：;注意！;复杂方案分析;流式细胞仪CD34阳性干细胞计数标准方案???ISHAGE;CD34计数中的问题;第一步;第二步;第三步;第四步;第五步;第六步;第七步;阴性对照;流式细胞仪数据保存及分析;功能强大的免费分析软件：PC版;第三局部

临床流式细胞仪应用简介;DNA倍体分析：DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测工程。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞外表标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。

所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反响并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。

流式细胞仪要求：488nm光源，575nm滤光片。;细胞生存能力实验，使用Heochest33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。

流式细胞仪要求：360nm光源，455nm滤光片

计数外周血中检测网织红细胞：使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的信噪比。

流式细胞仪要求：488nm光源，525nm滤光片，液量绝对计数系统

;血小板自身抗体检测：血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关病症，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。

仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片

移植交叉配型：原细胞毒实验，主要用于防止移植物超急性排拆反响。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。

仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片;

检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应：淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析