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第二节细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物1、差速离心2、密度梯度离心1）速度沉降主要用于分离密度相近而大小不一的细胞组分。2）等密度沉降主要用于分离不同密度的细胞组分。第30页，共54页，星期日，2025年，2月5日在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器,速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀第31页，共54页，星期日，2025年，2月5日A：速度沉降B：等密度沉降第32页，共54页，星期日，2025年，2月5日二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布与含量。第33页，共54页，星期日，2025年，2月5日Feulgen反应→DNA苏丹Ⅲ→脂类第34页，共54页，星期日，2025年，2月5日酶的显示是通过显示酶的活性来表明酶的存在，而不是酶的本身。将具有酶活性的组织放入含有一定底物的溶液中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物，它再与某种捕捉剂相反应,形成显微镜下可视性沉淀,即最终反应产物。如：细胞内酸性磷酸酶的显示先将切片放入含有酶底物(常用β-甘油磷酸钠)的溶液中孵育，底物经酶的作用，水解并释放出磷酸；用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应，形成微细的磷酸铅沉淀，此时，可在电镜下检出；如再用硫化铵处理时，磷酸铅被置换成硫化铅沉淀，可在光镜下见到。第35页，共54页，星期日，2025年，2月5日ABA:细胞色素氧化酶活性定位B:ATP酶活性定位第36页，共54页，星期日，2025年，2月5日三、特异蛋白抗原的定位与定性一般说来，发生在组织细胞内的抗原抗体反应是不可见的，但如果事先将某种荧光素、酶、同位素等用生化方法标记在抗体分子上（标记抗体），就能凭借特殊光镜及电镜等观察标本中的荧光现象、酶作用的沉淀物（颜色）、放射线径迹的有无和部位，由此判断是否发生了特异性的抗原抗体反应以及抗原物质的定位分布。第37页，共54页，星期日，2025年，2月5日四、细胞内特异核酸的定位与定性原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法。在显微与亚显微水平上的基因定位、特异mRNA表达等研究中起重要作用。光镜水平的原位杂交技术（同位素标记或荧光素标记探针） 电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）第38页，共54页，星期日，2025年，2月5日第1页，共54页，星期日，2025年，2月5日第一节细胞形态结构的观察方法一、光镜技术1、几种常见光学显微镜A普通光学显微镜普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体；③机械装置，用于固定材料和观察方便。第2页，共54页，星期日，2025年，2月5日第3页，共54页，星期日，2025年，2月5日B暗视野显微镜使用特殊的照明方法，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。应用：观察未经染色的活体或胶体粒子。第4页，共54页，星期日，2025年，2月5日第5页，共54页，星期日，2025年，2月5日C相差显微镜（PCM）1953年获得诺贝尔物理奖，相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光（直射光和衍射光）的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。应用：观察未经染色的标本和活细胞。一种介壳虫的染色体（PCM照片）第6页，共54页，星期日，2025年，2月5日在相差显微镜下观察的分裂期细胞变化过程第7页，共54页，星期日，2025年，2月5日D倒置显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具