植物原生质体的分离与培养.pptVIP

七.植物原生质体的发育和植株再生1植物原生质体在培养过程中，一般要经过下面几个不同的阶段：2细胞壁再生：5植株再生：有二条途径，一是从愈伤组织诱导形态发生；二是诱导胚状体。4愈伤组织或胚状体的形成：3细胞分裂：八.原生质体融合受精作用是一种自发的融合，而原生质体由于质膜表面带有负电荷，它们之间通常是相互排斥的，所以自然融合频率极低。所以要采用一定的方法加以诱导以促进原生质体的融合。02原生质体融合，也叫体细胞杂交，就是使分离出来的不同亲本的原生质体之间在人工控制的条件下，像性细胞受精作用那样互相融合成一体。01原生质体的融合过程原生质体的融合过程第五章植物原生质体的分离、培养与杂交杨柏云南昌大学生命科学与食品工程学院一.引言在细胞工程中，植物原生质体不但是植物细胞杂交良好的亲本，而且是植物细胞遗传工程的理想受体，此外，植物原生质体也是细胞生物学研究的很有用的实验材料。植物原生质体的分离和培养是达到这些目的的重要技术基础，因此，掌握和运用这一技术是十分重要的。物原生质体是脱掉了细胞壁的、仅有质膜包围、裸露的、活植物细胞。与完整的植物细胞相比，它有下列主要特点：离的原生质体是真正的单细胞，在同一时间内能得到大量的遗传上同质的原生质体，用它可象细菌细胞那样进行多种遗传学研究。生质体能超越性细胞的一些不亲和障碍，为较远缘的植物细胞杂交提供了融合亲本。010302二.植物原生质体的基本特点与作用二.植物原生质体的基本特点与作用原生质体能有效地摄取多种外源颗粒，如DNA，质粒、病毒、细菌和其它细胞器，因此在植物遗传工程中有重要作用。植物原生质体也和植物细胞一样，具有该植物体的全部遗传信息，在合适的培养条件下，它能象一粒种子那样发育成与其亲本相似的新的植物，即具有遗传全能性。二.植物原生质体的基本特点与作用植物原生质体为研究细胞壁的生物合成提供了方便。植物原生质体为研究细胞膜与信息的传递，能量的转换，物质的运输等基本现象之间的密切联系提供了可能。见图1：植物原生质体不但是良好的受体，同时又是分离细胞内各种细胞器，如细胞核、叶绿体、线粒体等的好材料。03010204三.植物原生质体的材料来源231研究表明，几乎能从植物的所有部位得到原生质体(详见图二)，其中以叶片为多，因为植物叶肉细胞的原生质体有下面几个优点：取材容易，植株可来自盆栽和温室栽培，也可在试管中培育无菌苗。原生质体在生理和遗传特性上比较一致。三.植物原生质体的材料来源123比较容易用酶解法分离。根尖组织也是植物原生质体的重要来源，它可由各种植物的种子萌发后取得。花粉经特异酶处理也能得到原生质体，在单倍体遗传育种中有特殊的用途。123三.植物原生质体的材料来源1原生质体也可以从组织培养的材料中大量获得。由于组织培养的严格条件，使得材料的重复性好，实验材料可做到常年供应。2值得注意的是，在考虑分离植物原生质体时，既要采用容易获得原生质体的植物材料，但更重要的是要选用易于再生完整植株的细胞。3详见图2?

四.植物原生质体的分离和纯化

生质体的分离01旱在1892年就有人用机械法分离原生质体。直到1960年，英国的科金(Cocking)首先采用酶解法分离原生质体，这一重要发现开辟了细胞工程研究的许多领域，作出了巨大的贡献。02四.植物原生质体的分离和纯化21酶解法有下面几个优点：l原生质体纯净度高；l能获得大量的原生质体；l条件温和，原生质体完整性好；下面以叶片和悬浮培养的细胞为材料介绍分离原生质体的一般步骤：(详见图3)435四.植物原生质体的分离和纯化材料的准备与消毒：取充分展开的幼叶，用自来水冲冼干净后，放入70%洒精中进行表面消毒，再放入2%的次氯酸钠溶液中处理10分钟，再用无菌水冲冼3-4次。悬浮培养的细胞一般是用胚性细胞，这有利于原生质体的再生。酶解：用镊子撕去叶子的下表皮后，切成2厘米见方的小片，使去表皮的一层朝下放入酶液中处理，在25-28摄氏度，黑暗条件下酶解3-4小时。若采用悬浮培养的细胞，则采用继代3天的细胞最好，经离心收集细胞，放入酶液中置低速转床酶解8-12小时。分离植物原生质体常用试剂见表1.(二)原生质体的纯化酶解悬浮液用400目的不锈钢或尼龙网过滤，以除去未消化的碎片。将含有原生质体的酶液收集到离心管中，低速离心使原生质体沉于管底，倒掉上清液。植物材料经酶解后纯化原生质体的步骤如下：(二)原生质体的纯化01在离心管中加入适量的洗涤液，并离心。02重复上述操作三次，使酶解液充分除去，最后用原生质体培养液洗涤一次。03上述的离心