核酸、多糖和脂类的组织化学.pptVIP

组织化学技术概论组织化学是在形态学基础上，通过化学或物理反应原理，研究细胞或组织中物质的化学组成、定位、定量以及代谢状态的学科。是组织学与生物化学的边缘学科。其目的是联系形态、化学成分和功能来了解细胞或组织的代谢变化。组织化学反应如与电镜技术结合，简称电镜组化。通过离心技术对分离的细胞进行的组织化学反应及细胞光度计的测量，则属于细胞化学的范畴。分布于组织中的物质能作为抗原时，则可在组织切片上观察该物质的抗原抗体反应，为此所采用的技术方法称为免役组织化学方法。一般组织化学方法应用一些化学试剂与组织或细胞内的生物大分子或有机小分子等物质发生化学反应，形成有颜色的反应物沉淀，以原位显示相应成分在组织或细胞内的分布或含量。01化学方法如各种酶类酶、PAS反应等02类化学方法03物理学方法如苏丹染料溶于脂类04物理化学方法05生物学特性方法如免役组织化学方法方法种类：反应产物应具有一定的稳定性。C要有重复性。方法稳定可靠，能被重复而结果不变。F反应产物必须为有色沉淀，定位于原位，不被溶解，且反应物沉淀颜色深度与相应物质含量有一定的量效关系。B反应具有一定的特异性，排除假阳性干扰。D反应具有一定的灵敏性，必须能将含量极微的物质显示出来。E在操作中必须保持组织或细胞形态结构的完整状态免受破坏，以确保反应产物的定位准确。A基本要求：组织的固定组织切片的制备染色漂洗封固DCAB基本程序固定液的选择核酸蛋白质多糖脂类切片的制备常规石蜡包埋能改变组织内的化学反应，甚至将细胞内的一些可溶性物质完全丢失，故经常采用冰冻切片的方法。最常用的是恒冷箱切片机。新鲜组织的制备：新鲜组织取出后应尽快放入骤冷剂内骤冷以防产生冰晶。常用的有力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。组织块不易过大过厚。固定液必须有足够的量。组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。注意核酸、多糖

和脂类的组织化学显示DNA和RNA的方法(Feulgen反应)原理1弱酸（1NHcl）水解细胞核中DNA，打开嘌呤碱基和脱氧核糖连接的双键，释放出醛基，然后与Schiff试剂结合。Schiff试剂的主要成分是碱性品红。碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红-硫酸复合物。碱性品红为醌状结构，硫酸破坏醌状结构而为无色的Schiff试剂。与标本接触后，无色品红即与核酸水解后释放出的醛基结合成具有醌状结构的红紫色化合物，从而使DNA着色。2试剂配制Schiff试剂1NHcl20ml；碱性品红1g；重亚硫酸钠1g；活性炭；蒸馏水200ml。偏重亚硫酸水10%偏重亚硫酸钠5ml；1NHcl5ml；蒸馏水90ml。临用时配。步骤在预热至60℃的1NHcl中水解8-10分钟。1NHcl在临用前预热半小时。冷1NHcl稍洗。入Schiff试剂40-60分钟。亚硫酸水洗三次，时间视颜色深浅而定。流水冲洗5分钟。蒸馏水洗。甘油明胶封固。结果：细胞核染成红紫色。对照：在入预热的盐酸之前，用DNA酶消化DNA，其他步骤相同。对照的切片DNA不着色。说明：在加入活性炭之前，试剂颜色为草黄色为好。试剂应配在棕色瓶中，并用黑色纸或塑料袋包好，密封避光保存，置于冰箱内，这样在4。C可保存半年左右。所用的瓶子要尽量小，防止SO2逸出。Hcl的水解时间和固定液种类有关。AB（高碘酸-雪夫，PAS反应）糖原的染色原理通过高碘酸的强氧化作用，打开糖残基中二醇基（CHOH-CHOH）的碳-碳键，形成二醛基（CHO-CHO）。这些二醛基与雪夫试剂中无色的亚硫酸品红反应生成紫红色的不溶性复合物（醛染料产物），从而证明多糖或粘多糖的存在。试剂配制1.0.1%过碘酸溶液2.亚硫酸水3.Schiff试剂切片入0.1%过碘酸溶液15分钟。蒸馏水洗。入Schiff试剂15-60分钟。甘油明胶封固。流水冲洗5-10分钟，蒸馏水亚硫酸水洗三次。010203040506操作步骤结果：糖原呈紫红色颗粒。碳水化合物组织化学染色（periodicacidSchiffreaction,PASreaction)对照用淀粉酶消化对照。切片用0.5%淀粉糖化酶37。C消化30-40分钟或室温1小时，流水冲洗，蒸馏水洗，其他步骤相同。经消化后的对照片糖原所在部位不呈紫红色（PAS阴性）。