植物细胞工程课件第五章细胞融合.pptVIP

0.6ml含原生质体悬浮液12ml0.45mol/L甘露醇400g5min0.45mol/L蔗糖碎片带（比原生质体轻）含原生质体带13%甘露醇溶液25%蔗糖溶液以柑桔为例过滤、离心果胶酶纤维素酶原生质体活力测定目测法在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。?FDA（二乙酸荧光素）法机理？01伊凡蓝法单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。02机理？有活力的Protoplast发荧光无活力的Protoplast被染色影响原生质体活力的因素分离材料的生理状态酶解条件酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压分离条件离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间环境条件操作环境的温度、分离用具的影响5.2.2动物单细胞的制备用胰蛋白酶、机械法或二者兼用来分离细胞，对其进行单层或悬浮培养，获得单个分散的细胞。自发融合诱发融合单击此处添加大标题内容NaNO3高pH-高Ca离子仙台病毒PEG电场……5.3细胞融合的方法病毒类是研究得最早的促融剂疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等致癌、致病病毒，都能诱导细胞融合毒性大，应用受到限制德国生理学家JohannesMüller1801-18585.3.1生物融合法-----仙台病毒法日本学者Okada1958年，日本学者冈田善雄（Okada）发现了HVJ病毒可促进细胞融合。仙台病毒（HVJ）毒力低，对人的危害小易被紫外线或β－丙炔内酯所灭活诱导细胞融合的不是仙台病毒内部的RNA，而是它的外膜。不同细胞融合速度不同，快的370C中5min即可。细胞的融合与病毒的数量、温度有关。每一细胞必须有足够数量的病毒颗粒附在细胞膜上，细胞才能凝集。融合要在较高的温度中进行，一般是370C。5.3.2化学融合法-----PEG法PEG诱导融合的特点融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。桥梁PEG被洗掉+-+--+-+-电荷重排原生质体膜接触融合+-+-+-+-+-+-PEG的作用机理稀释液：A液（g/100ml）pH6.0B液（g/100ml）pH10.5葡萄糖7.21甘氨酸0.375CaCl22H2O0.79NaOH0.169融合液：CaCl22H2O8~10mmolKH2PO40.7mmol甘露醇或山梨醇0.5~1.0molpH5.6诱导液：融合液＋PEG20～45％混合静止1min.加入PEG稀释洗涤加入培养基培养选择01P1加入稀释液02融合液P1P203P2融合洋葱根尖原生质体（40×）烟草叶肉原生质体（40×）烟草叶肉细胞和洋葱根尖细胞原生质体融合烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体的异源融合PEG融合的影响因素原生质体的群体密度PEG的相对分子量与含量Ca2+浓度和pH值融合液的渗透压和温度培养时间其他４-５％的原生质体悬浮液形成的异核体频率最高。PEG6000效果较好；含量以２５-３５％较为适宜。Ca2+可提高PEG诱导频率；同时与pH值相关。甘露醇浓度为0.4mol/L~0.7mol/L范围内。保温温度一般在２４０C左右。NO3-/NH4+;与DMSO并用异核发生率第四天达高峰，之后下降。5.3.3物理融合法-----电融合法电融合法（electrofusiontechnique）是20世纪80年代发展起来的细胞融合技术，以电降解及双向电泳的联合作用为基础。电融合过程的分子机制++正极+++++++++单击此处输入你的正文负极+++++++++++0102++++0304烟草原生质体（40×）原生质体成串（40×）原生质体融合电融合仪的结构特点交变电场部分高频直流电击部分形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。生化鉴定：同功酶鉴定。分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。细胞融合

CellFusion细胞工程电子课件华中农业大学生命科学技术学院细胞融合的概念与意义融合细胞的制备细胞融合的方法融