细胞基本培养技术.pptVIP

消化分离法：组织消化法是在把组织剪切成较小体积的基础上，应用生化和化学手段进一步分散组织的方法。最后成细胞团或单个细胞，然后加入培养液制成细胞悬液，接种入培养容器中后，细胞容易生长增殖。各种消化剂的作用机制各不相同，根据组织的不同，可选用特定的消化手段。1．消化培养法(单细胞培养）原代细胞培养类型准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟；注意：组织块、胰蛋白酶、培养液等易受紫外线伤害的物品，最好在培养时再携入操作野；如预先置入，需用纸张覆盖，以免受射线影响；01处理组织：把组织块置入烧杯中，用Hanks液漂洗2～3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30～60分钟；02剪切：用眼科剪把组织块切成2～3毫米大小的块(用手术刀切割亦可)，以便于消化；03消化：加入比组织块总量多30～50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；或用恒温水浴，或置)37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块(必要时可继续进行消化)；低速(500～1000转／分)离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液(如用其它酶或EDTA等消化，需用Hanks液洗脱一两次后，再加入培养液)；计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；对大多数细胞来说，pH要求在7.2～7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整；培养：置入36.5度温箱培养；如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。01022、组织块培养法:

进行培养操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应取备品更换。布局：原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央(图4-1)。工作由始至终要保持一定顺序性。培养操作注意事项组织或细胞在末做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在使用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。培养用瓶开瓶以后，皆应保持45度斜位或平放，吸取营养液BSS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。

第三节基本培养操作技术当初代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，进而扩展汇合，占满一切空间，此时需要进行分离培养。这一操作称传代或再培养。80%汇合或刚汇合细胞是理想传代阶段。为什么要进行传代？一、传代培养法1、贴壁细胞传代贴壁细胞细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板贴附生长型细胞++++++++++++细胞的贴附过程贴附物质带正电荷细胞带负电荷0102030405成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起上皮细胞：扁平、多角形、园核可连成单层010203材料和试剂01020304Hela细胞RPMI1640生长液、碳酸氢钠、双抗EDTA消化液（0.02%）05培养瓶、无菌吸液管（5ml、1ml）、弯头毛细滴管、废液缸图5-6消化法传代培养步骤【程序】吸除培养瓶内旧培养液；向瓶内加入EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限；置温箱中2～5分钟(或在室温中，把培养瓶放在倒立显微镜台上镜下观察)，当发现细胞胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化；吸除消化液用吸管吸取营养液（已经加入双抗并调好pH值）加入培养瓶，轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液；吹打勿用力过猛，以免伤害细胞；计数板计数后(如非实验用，不计数亦可)，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。2、悬浮细胞的传代培养

悬浮生长型细胞123HL-60细胞RPMI1640生长液、碳酸氢钠、双抗培养瓶、无菌吸液管（5ml、1ml）、弯头毛细滴管、废液缸123材料和试剂l、选生长良好的HL-60细胞一瓶轻轻加入等量的生长液。01、用无菌吸液管轻轻吹打，使HL-60细胞均匀悬浮然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培养