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伪狂犬病毒的gE蛋白胞外区真核表达以及单克隆抗体制备

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伪狂犬病毒的gE蛋白胞外区真核表达以及单克隆抗体制备

摘要：伪狂犬病毒（PV）是一种高度传染性疾病，对畜牧业造成巨大经济损失。本研究旨在通过构建伪狂犬病毒gE蛋白胞外区（E2）的真核表达系统，并制备针对该蛋白的单克隆抗体，为PV的快速诊断和疫苗研发提供技术支持。首先，通过基因克隆、原核表达和纯化，获得了重组gE蛋白。然后，将该蛋白的E2区构建入真核表达载体，并在哺乳动物细胞中进行表达。随后，采用亲和层析法纯化重组E2蛋白，并以此作为免疫原免疫Balb/c小鼠，通过细胞融合和ELISA筛选，成功制备了针对gE蛋白E2区的单克隆抗体。本研究结果为PV的快速诊断和疫苗研发提供了新的思路和方法。

伪狂犬病毒（PV）是一种高度传染性疾病，主要感染猪、犬等家畜，引起急性出血性败血症，给畜牧业带来巨大的经济损失。PV的病原学研究和防控措施一直是兽医科学领域的重要课题。gE蛋白是PV的主要免疫原，在病毒感染过程中发挥重要作用。本研究旨在通过构建伪狂犬病毒gE蛋白胞外区（E2）的真核表达系统，并制备针对该蛋白的单克隆抗体，为PV的快速诊断和疫苗研发提供技术支持。

一、1.材料与方法

1.1实验材料

(1)实验材料主要包括伪狂犬病毒（PV）阳性病料、Balb/c小鼠、大肠杆菌DH5α、哺乳动物细胞系293T、pET-32a(+)表达载体、pEGFP-C1真核表达载体、PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、T4DNA连接酶、DNA分子量标准、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒、蛋白质纯化试剂盒、细胞培养试剂、免疫试剂、ELISA试剂盒等。这些材料是实验顺利进行的基础，其中伪狂犬病毒阳性病料是获取目的基因的来源，大肠杆菌DH5α和哺乳动物细胞系293T是基因克隆和蛋白表达的平台，pET-32a(+)和pEGFP-C1真核表达载体是基因克隆和真核表达的关键载体，PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶等是基因克隆的必需工具，质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒、蛋白质纯化试剂盒等是质粒提取、PCR产物纯化和蛋白纯化的必备试剂。

(2)在实验过程中，我们严格按照操作规程进行实验材料的准备。首先，从伪狂犬病毒阳性病料中提取总RNA，通过RT-PCR扩增gE基因片段。然后，将扩增得到的gE基因片段克隆到pET-32a(+)表达载体中，构建重组表达质粒。接着，将重组表达质粒转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆并进行PCR鉴定。最后，将阳性克隆进行IPTG诱导表达，收集重组蛋白并进行纯化。在真核表达实验中，我们将gE基因的E2区克隆到pEGFP-C1真核表达载体中，构建真核表达质粒。将真核表达质粒转染293T细胞，收集表达蛋白并进行纯化。此外，我们还准备了细胞培养试剂、免疫试剂、ELISA试剂盒等，用于后续的单克隆抗体制备和鉴定。

(3)为了确保实验材料的质量，我们对所有实验材料进行了严格的筛选和鉴定。首先，伪狂犬病毒阳性病料经过PCR检测，确认其阳性。其次，大肠杆菌DH5α和哺乳动物细胞系293T经过连续传代培养，确保其遗传稳定性。再次，pET-32a(+)和pEGFP-C1真核表达载体经过PCR和测序鉴定，确认其正确性。此外，我们使用琼脂糖凝胶电泳试剂盒、质粒提取试剂盒、蛋白质纯化试剂盒等对PCR产物、质粒和蛋白进行了纯化，确保其纯度。最后，细胞培养试剂、免疫试剂、ELISA试剂盒等经过验证，确保其质量符合实验要求。通过以上措施，我们为实验的顺利进行提供了可靠的实验材料。

1.2重组gE蛋白的构建与表达

(1)本研究首先通过RT-PCR技术从伪狂犬病毒阳性病料中成功扩增出gE基因，扩增片段长度约为1500bp。随后，将扩增得到的gE基因片段克隆到pET-32a(+)表达载体中，构建重组表达质粒。通过测序鉴定，确认重组质粒的构建成功。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆。PCR鉴定结果显示，阳性克隆中插入的gE基因片段与预期长度一致。

(2)对阳性克隆进行IPTG诱导表达，收集重组蛋白。通过SDS分析，发现重组gE蛋白在大肠杆菌中表达，分子量约为50kDa，与预期一致。此外，通过Westernblotting实验，利用针对gE蛋白的抗体进行检测，证实重组gE蛋白在大肠杆菌中得到了表达。通过不同IPTG浓度和时间诱导，优化了重组gE蛋白的表达条件，最终获得较高表达量的重组蛋白。

(3)将纯化的重组gE蛋白进行Westernblotting实验，结果显示该蛋白与伪狂犬病毒阳