硫酸软骨素的精制与纯化.ppt

五、季铵盐络合法在纯化中的应用第21页，共53页，星期日，2025年，2月5日硫酸软骨素可以与一些阳离子洗涤剂如氯化十六烷基吡啶(CPC）和氯化十六烷基三甲铵（CTAB）形成沉淀，该沉淀又可在一定无机盐临界浓度下解离。各种糖胺聚糖分子中可电离集团的位置、数量及连接方式的差异，使其与季胺基的亲和力不同，因此，使用不同浓度的盐可以将发生结合的糖胺聚糖阴离子分别取代下来，各种糖胺聚糖的最低解离盐浓度各有不同，据此可以将不同糖胺聚加以分离，从而使硫酸软骨素得以纯化第22页，共53页，星期日，2025年，2月5日以下关于CPC的应用，大多同样适用于CTABCPC的质量各生产厂家有较大差异，如有必要，可以用水或丙酮重结晶予以纯化CPC水溶液在260nm有强烈吸收，因此本身也是一种灵敏而简便的检测方法CPC可配制成1～10%的水溶液糖的最适浓度在0.1～1%每沉淀一份糖可用三份CPC，最终混合液中游离CPC应不低于0.05%第23页，共53页，星期日，2025年，2月5日CPC复合物中硫酸软骨素的回收CPC硫酸软骨素复合物需要经解离方可回收硫酸软骨素，方法主要有以下三种1、复合物溶于盐溶液：用小于4mol/L的氯化钠，在40oC下不断搅拌解离，解离后加入3～5倍体积乙醇，硫酸软骨素沉淀析出，或向解离液中加入碘盐或硫氰酸盐，以去除季铵盐离子；解离液中的季铵盐离子也可用有机溶剂抽提去除第24页，共53页，星期日，2025年，2月5日2、季铵盐-硫酸软骨素复合物溶于有机溶剂：将复合物先经水洗涤除去无机盐后，37oC下加入丙酮或乙醇，所得溶液用不能溶于上述溶剂的无机盐，硫酸软骨素即可与加入的无机盐中的阳离子形成不溶性沉淀析出3、季铵盐-硫酸软骨素复合物充分粉碎后，用无机盐饱和的乙醇震荡数小时，复合物中季铵盐离子即与无机盐中的阳离子发生交换，不溶性的硫酸软骨素可经离心或过滤收集第25页，共53页，星期日，2025年，2月5日六、CPC法与其他方法结合在纯化中的应用第26页，共53页，星期日，2025年，2月5日目前，CPC法已经发展成一种既适用于微量分析，又可用于大规模生产的方法CPC-盐梯度纯化法：将糖胺聚糖混合液溶于盐溶液，加入CPC(CPC预先溶于等浓度的盐溶液，浓度为10%)，逐步稀释混合液，分批收集沉淀；或将混合糖胺聚糖水溶液与3倍CPC混合，随后逐步升高盐浓度分批解离使硫酸软骨素得以纯化第27页，共53页，星期日，2025年，2月5日CPC法在分离硫酸软骨素A和硫酸软骨素C中的应用硫酸软骨素A、C结构相似，单独用CPC法进行分离是非常困难的，但两者的CPC复合物在有机溶剂中的溶解度存在差异，因此可采用CPC-纤维素柱结合加以分离，如硫酸软骨素A可以40%丙醇/20%甲醇/1.5%乙酸洗脱，而硫酸软骨素C则保留在柱上第28页，共53页，星期日，2025年，2月5日CPC法在分离硫酸软骨素（A、C）和硫酸皮肤素（硫酸软骨素B）中的应用艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸pK值存在差异（分别为3.6和3.1），因此可在合适的条件下加以分离，在适当的酸性条件下，当艾杜糖醛酸的解离受到抑制时，硫酸皮肤素-CPC复合物的溶解度大大低于硫酸软骨素，此时如在0.1mol/LHAc/0.7mol/LMgCl2溶液中，硫酸皮肤素析出，而硫酸软骨素保留在溶液中第29页，共53页，星期日，2025年，2月5日CPC法在分离不同硫酸化程度的硫酸软骨素中的应用根据硫酸化程度的不同，硫酸软骨素可分为三组：非硫酸化的软骨素、单硫酸化的硫酸软骨素、多硫酸化的硫酸软骨素，糖胺聚糖-CPC可溶于某些有机溶剂，当和这些复合物的丁醇溶液相平衡的水相发生微小的盐浓度变化时，有机相中的硫酸软骨素即可向水相转移，据此，逐步提高水相的盐浓度，即可分离不同硫酸化程度的硫酸软骨素第30页，共53页，星期日，2025年，2月5日需要指出的是，由于各种硫酸软骨素在分子量、硫酸化程度及方式和糖醛酸组成等方面的不均一性，因而企图把消化液中的硫酸软骨素混合物分离成单一纯组分往往是不合实际的下图为Sigma公司硫酸软骨素C标准品的液相分析第31页，共53页，星期日，2025年，2月5日可见，即便是Sigma公司硫酸软骨素标准品，也不可能做到结构的绝对均一第32页，共53页，星期日，2025年，2月5日七、盐溶液沉淀法第33页，共53页，星期日，2025年，2月5日糖胺聚糖在水溶液中经有机酸、碱或盐处理即发生不溶性沉淀，其中部分反应已用于糖胺聚调的分离纯化中透明质酸和肝素在高浓度乙酸溶液中能直接沉淀析出透明质酸在高浓度硫酸铵溶液中可被吡啶沉淀肝素与盐酸联苯胺可发生专一性沉淀牛肺提取液中经硫酸钡-乙酸沉淀，结合其他方法能得到