DB37T 4674-2023 猪塞尼卡谷病毒的检测 重组酶恒温扩增法.docxVIP

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山东省地方标准

DB37/T4674—2023

猪塞尼卡谷病毒的检测重组酶恒温扩增

法

2023-11-14发布2023-12-14实施

山东省市场监督管理局发布

DB37/T4674—2023

I

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。

本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

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猪塞尼卡谷病毒的检测重组酶恒温扩增法

1范围

本文件描述了猪塞尼卡谷病毒（SenecaValleyvirus,SVV）的重组酶恒温核酸扩增检测（RecombinasePolymeraseAmplification）方法。

本文件适用于猪塞尼卡谷病毒的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4试剂或材料

除非另有规定，仅使用分析纯试剂。所用液体试剂均需使用无DNA/RNase的容器进行分装。

4.1RNA提取试剂盒：市售。

4.2重组酶恒温扩增试剂盒：市售。

4.3水：GB/T6682，一级。

4.4PBS溶液：pH值7.4。

称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g、氯化钠(NaCl)8g、氯化钾(KCl)0.2g，加灭菌水约800mL充分搅拌溶解，加入浓盐酸调pH值至7.4，定容至1000mL。

4.50.1%DEPC水。

1000mL水中加1mLDEPC，放在1000mL容量瓶中静置4h后备用。

4.6重组酶恒温扩增检测引物：按附录A规定。

4.7阳性、阴性对照。

——阳性对照：带有SVV序列DNA全长的质粒。——阴性对照：已知SVV阴性样本的DNA。

5仪器设备

5.1荧光定量PCR仪：配有配套反应管（板）。支持多通道检测。

5.2分析天平：精度为1mg。

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5.3高速冷冻离心机：转速不低于13000g/min。

5.4冰箱：2℃~8℃和-20℃以下。

5.5酸度计。

5.6电热恒温水槽：室温至100℃。温度精度±0.5℃。

5.7涡旋振荡器。

5.8微量移液器：10μL、20μL、100μL、1000μL。

5.9离心管：1.5mL。无DNase和RNase。

6试验步骤

6.1样品

符合GB19489和NY/T541中关于实验室生物安全和兽医诊断样品的采集和保存的要求。

6.1.1样品采集

6.1.1.1棉拭子样品

无菌采集猪口鼻棉拭子。6.1.1.2组织样品

按照NY/T541兽医诊断样品采集、在运抵检测地点前的样品保存与运输技术规范确定的规程，无菌采集病死猪的淋巴结、脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织样品。

6.1.2样品的保存

2℃~8℃不超过24h，-20℃以下不超过3个月，-70℃以下不超过10年。

6.1.3样品处理

6.1.3.1棉拭子样品处理方法

口鼻拭子管6000g/min震荡45s，取200μL进行RNA提取。6.1.3.2淋巴结、脾、胸腺等组织样品处理

取0.05g(±0.01g）组织块放入盛有500μLPBS缓冲液的研磨管中，6000g/min震荡研磨45s，制成约10%的组织匀浆液，5000g/min离心5min，取200μL上清液进行RNA提取。

6.2RNA的提取

按RNA提取试剂盒说明书提取样品和对照组的RNA。提取的RNA应立即检测，否则应置于-70℃冻存。

6.3重组酶恒温核酸扩增

6.3.1扩增试剂准备

设50μL重组酶恒温核酸扩增反应体系，