工业菌种的选育及改进.pptVIP

例如，庆丰霉素产生菌和井冈霉素产生菌的原生质体种间融合，得到的重组子中有的产生聚醚类抗生素，有的产生环状多肽类新的抗生素。02有效的种间原生质体融合，有可能发生不同菌种的调节基因和结构基因的重组，诱发原处于抑制状态的沉默基因的表达。特别是在抗生素产生菌中可以产生新的杂种抗生素。012、产生新的产物将外源DNA通过体外重组后，导入受体细胞，使其在受体细胞中复制、转录、翻译表达的技术称为基因工程或DNA体外重组技术。这项在微生物遗传学和分子生物学基础理论上发展起来的新兴技术，不仅是生命科学研究发展的里程碑，也使现代生物技术产业发生了革命性的变化。第五节基因克隆（基因工程技术）概念：01021974年，波依耳（Boyer,USA）和科恩（Cohen）首次在实验室中实现了基因转移（genetransform），为基因工程（geneengineering）开启了通向现实的大门，从而使人有可能在实验室中组建按人们意志设计出来的新生命体。这样我们就可以通过这些重组体的培养而“借腹怀胎”地获得所需要的目标产品。此后，利用微生物细胞表达和生产了许多重组基因产物，包括受体细胞自身原有的和原来不能产生的各种物质。例如许多在疾病诊断、预防和治疗中有重要价值的内源生理活性物质作为药物已应用了多年，像治疗糖尿病的胰岛素，治疗侏儒症的人生长激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类、凝血因子以及某些疫苗等。二、发展历史由于上述药物在传统制药工业制造过程中或是材料来源困难，或是制造技术问题，或是造价过于昂贵，而无法大量生产并在临床上广泛付诸应用。然而利用微生物生长繁殖迅速，人工培养方便等特点，将重组基因导入微生物细胞来生产这些生理活性物质，从根本上解决了上述问题。1982年第一个基因工程产品---人胰岛素在美国问世，吸引和鼓励了大批科学家投身这一领域的研究和开发，获得了大批的成果，也产生了巨大的经济效益和社会效益。目的基因的取得（即外源基因或供体基因）载体系统的选择目的基因与载体基因的构建重组载体导入受体细胞“工程菌”的表达、筛选及鉴定工程菌生产性试验及大规模生产010302040506三、基因工程的基本操作步骤图3.7将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤从适当的供体生物包括微生物、动物或植物中提取；01通过逆转录酶的作用，由mRNA合成cDNA（complementaryDNA，即互补DNA）；02由化学合成方法合成有特定功能的目的基因03（一）目的基因的取得取得具有生产意义的目的基因主要有3条途径：优良载体的选择基因工程使用的载体分为克隆载体和表达载体。无论原核基因还是真核基因要在大肠杆菌中复制和表达，都必须将其与合适的表达载体连接后导入宿主细菌，才能表达成蛋白质。是一个具自我复制能力的复制子（replicon）；1能在受体细胞内大量增殖；2载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上；3其上必须有一种选择性遗传标记，以便及时高效地选择出工程菌。41、克隆载体优良的克隆载体必须具备的条件：2、表达载体表达载体必须具备以下条件：1）应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。【启动子是指在一条DNA链内，在转录起始期间可以被RNA聚合酶识别并结合的一段DNA序列。转录起始位点通常在启动子序列内。】2）应具有使启动子受到抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。因外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增值，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。例如可先使宿主细胞快速生长增值到相当量，再通过瞬时消除阻遏，使所表达的蛋白质在短时间内大量积累，同时也可减少表达产物的降解。阻遏子的阻遏作用可以由物理（如温度）、化学（如IPTG、IAA等）因素进行调节，这样可人为地选择启动子启动转录mRNA的时机。所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列（核糖体结合序列）。应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因。同时强终止子所产生的mRNA较为稳定。诱导表达时，由于强启动子所致的高水平转录反过来会影响质粒DNA自身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象。因此在外源基因的下游安置强终止子可以克服由质粒转录引起的质粒不稳定。【终止子：位于操纵子或基因编码区末端的一段DNA序列，在原核生物中，在转录部分末端的终止子常有一个反向重复序列和紧接着一小段U。】3、载体的常见类型根据受体细胞不同，目前具备上述条件的载体有如下：1）原核受体细胞入噬