血液分子生物学基因治疗.ppt

病毒的分类（1995年）*DNA病毒*RNA病毒*逆转录病毒病毒的增殖（复制）*吸附与穿入：细胞膜表面的特异性受体。*脱壳：溶菌酶作用下，病毒体释放出基因组核酸。*生物合成：病毒核酸的复制及蛋白质的合成。*转配与释放：复制出子代病毒的核酸与蛋白质，在细胞内装配为成熟的病毒体；并从宿主细胞释放。第30页，共60页，星期日，2025年，2月5日逆转录病毒(RNA)常用的病毒载体DNA病毒1)逆转录病毒（retrovirus）目前应用最多、最成功.病毒感染细胞后，其基因组RNA经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。第31页，共60页，星期日，2025年，2月5日例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：LTRLTRψgagpolenvU3RU5U3RU5U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点。Ψ=病毒包装信号，gag=核心抗原，pol=逆转录酶，env=外壳蛋白。第32页，共60页，星期日，2025年，2月5日

逆转录病毒载体构建的技术路线*gag,pol,env序列去除，保留LTR和Ψ，使逆转录病毒成为无复制能力的缺陷病毒。*在gag,pol,env序列去除的区域，插入目的基因序列和报告基因序列（如GFP)。*将目的基因、其两端的LTR以及Ψ这一序列插入经改造的质粒内。*将gag-pol序列插入经改造的质粒*将env序列插入经改造的质粒第33页，共60页，星期日，2025年，2月5日质粒*是位于细菌内的双链、闭环的DNA分子，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。*他们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。*质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物等。第34页，共60页，星期日，2025年，2月5日ori5’LTRΨ目的基因标记基因3’LTR抗生素基因第35页，共60页，星期日，2025年，2月5日第36页，共60页，星期日，2025年，2月5日逆转录病毒载体优点：①高效感染宿主细胞，转染率可达100%②病毒基因和所载的外源基因都可能表达③宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留第37页，共60页，星期日，2025年，2月5日缺点①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；②病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的外源基因可能不适当的表达；第38页，共60页，星期日，2025年，2月5日③逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包装信号。第39页，共60页，星期日，2025年，2月5日（6）受体载体转移法将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。重组质粒配体细胞膜复合物第40页，共60页，星期日，2025年，2月5日（三）靶细胞的选择靶细胞是指接受外源Gene的体细胞选择靶细胞的原则是：1）便于体外培养和进行遗传技术操作；2）易于由人体分离又便于输回体内；3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至几年，或整个生命周期）；4）易于受外源遗传物质转化。第41页，共60页，星期日，2025年，2月5日常见的靶细胞外周血T淋巴细胞上皮细胞内皮皮肤成纤维细胞造血干细胞——β地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等基因治疗肝细胞——家族性高胆固醇血症、低密