酶联免疫分析法 (2).ppt

一、化学发光分析1、化学发光（chemiluminescence，CL）一些物质在进行化学反应时，吸收了化学反应过程中产生的化学能，使得分子外层电子激发到激发态，生成激发态产物。当电子从激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级时，以光辐射的形式释放能量，这个发光过程称为化学发光，其反应过程如下：发光效率表示一个化学发光分子的量子产率，指每摩尔反应物辐射出光子的量。第三节发光酶联免疫分析第63页，共92页，星期日，2025年，2月5日2、化学发光分析化学发光分析是根据化学反应产生的光辐射确定物质含量的一种痕量分析方法。化学发光免疫分析（CLIA）是将化学发光反应与免疫反应相结合而对抗体、抗原或半抗原进行测定的一种免疫分析方法。第三节发光酶联免疫分析第64页，共92页，星期日，2025年，2月5日3、化学发光剂用作标记的化学发光剂应符合以下条件：①能参与化学发光反应；②与抗原或抗体偶联后能形成稳定结合物；③偶联后仍保留高的量子产率和反应动力；④不改变或极少改变被标记物的物理化学特性，特别是免疫活性。常用的化学发光剂有吖啶酯类化合物、氨基苯二酰肼类化合物、咪唑类化合物、苯酚类化合物、芳基草酸酯类化合物等。第三节发光酶联免疫分析第65页，共92页，星期日，2025年，2月5日（1）吖啶酯类化合物吖啶酯是三环有机化合物，很容易氧化。当其在碱性介质中氧化时，经历共价键的断裂，产生二氧酮的中间体，然后形成电激发的N-甲基吖啶酮。当它回复到基态时在430nm处释放出光子。在加入H2O2及随后加入NaOH调节至所需pH之前维持一低pH以实现最佳氧化过程，可加速其氧化反应。吖啶酯氧化反应如图7-12所示。第三节发光酶联免疫分析第66页，共92页，星期日，2025年，2月5日图7-12吖啶酯氧化反应过程第三节发光酶联免疫分析第67页，共92页，星期日，2025年，2月5日吖啶酯类化学发光剂的典型代表是光泽精（N,N′-二甲基吖啶硝酸酯）。它在碱性条件下，与H2O2等过氧化物作用形成发光体激发态N-甲基吖啶酮。能促使光泽精激发的物质还有丙酮、次黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、羟胺及抗坏血酸等。光泽精的氧化反应如图7-13所示。第三节发光酶联免疫分析第68页，共92页，星期日，2025年，2月5日图7-13光泽精的氧化反应第三节发光酶联免疫分析第69页，共92页，星期日，2025年，2月5日吖啶酯类化合物作为化学发光标记物有显著的优点：①氧化反应不需催化剂，只需要在碱性环境中就可以进行，发光反应快速，在1s内光子散射达到高峰，整个过程在2s内完成，可充分计数，背景噪声低。②这类化合物与被标记物的结合发生在分子一定部位，在氧化反应过程中，结合物被分解，吖啶酯分子从发光的部分断裂并分离下来，所以吖啶酯的发光不受抑制，敏感度不受标记反应的影响，试剂稳定性好。第三节发光酶联免疫分析第70页，共92页，星期日，2025年，2月5日二、ELISA酶联方法和试验方法1、ELISA酶联方法ELISA酶联方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。（1）戊二醛交联法戊二醛是一种双功能团试剂，它可以联结具有氨基的酶和蛋白质。戊二醛交联法有一步法、两步法两种。第二节酶联免疫吸附分析法第31页，共92页，星期日，2025年，2月5日图7-2戊二醛一步法反应原理①一步法将戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。该法操作简便、有效，重复性好。缺点是交联反应是随机的，酶与酶、抗体与抗体之间有可能交联。第二节酶联免疫吸附分析法第32页，共92页，星期日，2025年，2月5日图7-3戊二醛二步法反应原理②两步法先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体；或先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，有助于本底的改善。第二节酶联免疫吸附分析法第33页，共92页，星期日，2025年，2月5日（2）过碘酸盐氧化法本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶（HRP）的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为活泼的醛基，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。图7-4过碘酸盐氧化法

第二节酶联免疫吸附分析法第34页，共92页，星期日，2025年，2月5日2、ELISA试验方法ELISA法