生物技术制药 (2).ppt

一、人-鼠嵌合抗体制备方法：提取杂交瘤细胞系的mRNA，经过逆转录成cDNA，并以其为模板，采用特异引物，用PCR方法分别扩增VL和VH基因，再分别连接真核表达所需的上游启动子、前导肽序列和下游剪切供体信号、增强子真核调控序列后，将VL基因克隆到人Ig的CL基因表达载体上，将VH基因克隆到人IgG1的C基因真核表达载体上，再将人-鼠嵌合的V-C区基因质粒DNA等量混合，在脂质体介导下共转染骨髓瘤细胞SP2/0，转染后用含霉酚酸进行筛选，形成集落的细胞即为共转染细胞，所分泌的抗体为嵌合抗体。它保持鼠源性单克隆抗体的抗原结合的特异性，但对人的免疫原性大幅下降了。如若用人IgG1或IgG3的C基因替换鼠IgG1或IgG2b，则可有效地加强多肽的ADCC效应与免疫调理作用。第30页，共46页，星期日，2025年，2月5日二、改形抗体Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补性决定区（CDR区），而不是整个可变区。H和L链各有三个CDR，其他部分称为框架区。如果用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源性部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。这种改形抗体（reshapingantibody）又称CDR移植抗体（CDRgraftingantibody）。书中表4-5给出几种改形抗体及其潜在的临床应用。第31页，共46页，星期日，2025年，2月5日三、小分子抗体基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子量仅为原抗体的1/80~1/3。也就是说，保留了CDR区，而Ig分子的C区不表达。现在研制的小分子抗体有以下几种类型：（1）Fab抗体，由完整的轻链和重链（VH和CH1）所组成。（2）FV抗体，由VH和VL组成，天然FV片段中VH和VL为非共价性结合。（3）单链抗体（singlechainantibodySCA或singlechainFV,SCFV），由VH和VL通过一段连接肽（linker）连接而成的重组蛋白。有分子量小、穿透力强、免疫原性小特点，可与效应分子相连接构建新功能抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体的理想元件。（4）单域抗体，由VH(VL)单个可变区组成的，只有抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特异结合能力也强。（5）最小识别单位（MRU）是由单个CDR区构成的小分子抗体，亲和力较低。第32页，共46页，星期日，2025年，2月5日四、双功能抗体双功能抗体就是双特异性抗体（biospecificantibody,BsAb）。它是一种非天然性的抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。1、化学交联法2、生物学方法（杂种-杂交瘤）杂交瘤细胞与脾细胞融合得到可分泌两种亲代抗体和杂种抗体的杂种-杂交瘤细胞。3、基因工程方法采用适当的接头连接不同抗体的VH和VL区，使它们不能形成链内的分子内配对，让其形成原抗体的分子内配对，构建双特异性（SCFV)2。第33页，共46页，星期日，2025年，2月5日第1页，共46页，星期日，2025年，2月5日第四章抗体制药第一节概述第二节单克隆抗体第三节鼠源性单克隆抗体的改造第四节基因工程抗体和抗体工程第五节抗体诊断试剂第六节抗体治疗药物第2页，共46页，星期日，2025年，2月5日第一节概述1890年：Behring和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。1937年：Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（?）球蛋白、乙种（?）球蛋白和丙种（?）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。20世纪60年代初期：抗原决定簇，精制单价血清。1975年：K?hler和Milstein等，单克隆抗体，其具有高度特异性、均一性，以及来源稳定可大量生产等特点。1984年：人-鼠嵌合抗体1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分子过大的问题得以解决，可仅作为与抗原特异性结合试剂。第3页，共46页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体的应用用于疾病的诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，或用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定。用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。单克隆抗体还可作为载体制备导向药物。但是要解决以下两个问题：（1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。第4页，共46页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体的应用基因工程技术为解决这两个问