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稳定细胞系的构建;二、转染
转染试剂初定为LipofectamineTM2000
1、转染前24h，消化牛乳腺上皮细胞并计数，以1X104个细胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能到达80%—90%的融合。
2、转染前2h，更换新鲜的1640培养基(10%FBS，无双抗)。
3、用1640培养液(无FBS，无双抗)分别稀释2uL,4uL,6uL,8uL质粒至体积为50uL，质粒浓度到达0.01ug/uL-0.04ug/uL,轻轻混匀，室温作用5min。
4、用1640培养液(无FBS，无双抗)稀释4份Lipofectamine20004uL至体积为50uL，轻轻混匀，室温作用5min。
;5、分别混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine2000，此时单份体积为100uL，质粒DNA跟转染试剂比分别为〔1:2，1:1，1.5:1，2:1ug/ul〕轻轻混匀，室温作用20min。
6、将12孔板中的旧培养液吸出，用1640培养液(无FBS〕洗两次，参加400ul1640(无FBS〕培养液。
7、逐滴参加脂质体/DNA混合物到不同孔中，边加边前后来回摇动培养板，轻轻混匀。同时设立未转染〔500uL无FBS1640培养液〕和转染空白载体对照〔4uLLipofectamine2000+496uL无FBS1640培养液〕。
8、在细胞培养箱中孵育6h，弃去培养液，参加1640培养液(10%FBS)培养48小时。;三、筛选
1、转染后转染后观察待细胞集合80%时，吸去培养液，参加最正确筛选浓度的G418筛选液，此后每两天换相同浓度6418筛选液1次，每天观察细胞生长及死亡情况。
2、待对照孔的细胞全部死亡后，将G418的浓度换成维持浓度(筛选浓度减半)。
3、继续培养细胞，每两天换1次液，直到阳性克隆可见为止。
4、阳性克隆增大后，消化计数，用培养液稀释，使细胞浓度为50～60个/mL，于96孔培养板中每孔加0.1mL(五六个细胞/孔)。接种2排，剩余细胞悬液用培养液作倍比稀释，再接种2排，如此类推，直至使每孔含0.5～1个细胞。接种四小时后观察，对只有1个细胞的孔进行标计。;
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