高效液相色谱 (7).ppt

分离原理：物质在固定相上的吸附作用不同三、液-固吸附色谱法(LSAC)固定相：吸附活性强弱不等的吸附剂硅胶、氧化铝、聚酸胶等。流动相：各种极性的洗脱剂用途：非极性溶剂中、具有中等相对分子质量且为非离子型的试样。特别适用于分离异构体第57页，共98页，星期日，2025年，2月5日原理：不同待测离子对固定相亲和力的差别固定相：基质：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶表面键合离子：阳离子和阴离子交换树脂四、离子交换色谱法（IEC）流动相：一定pH和盐浓度的缓冲溶液用途：适用无机离子、有机离子混合物的分离例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。第58页，共98页，星期日，2025年，2月5日离子对AB具有疏水性，被非极性固定相提取不同待测离子A1，A2…与B离子间成对能力不同，形成不同疏水性离子对，从而保留值不同原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B加入到流动相中形成离子对AB，间接改变待测离子保留特性五、离子对色谱法（IPC）如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液用途：主要用来分离强极性有机酸和有机碱第59页，共98页，星期日，2025年，2月5日固定相：化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。流动相：作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。六、尺寸排阻色谱法（SEC）常用流动相——四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水原理：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离。第60页，共98页，星期日，2025年，2月5日凝胶过滤色谱：以水或缓冲液作流动相主要适合于水溶性高分子的分离凝胶渗透色谱：以有机溶剂作流动相主要适合于脂溶性高分子的分离用途六、尺寸排阻色谱法（SEC）特点：固定相与分子间作用力趋于零，柱寿命长相对分子质量差别必须大于10％才能分离第61页，共98页，星期日，2025年，2月5日七、亲和色谱法（AC）原理：利用生物大分子和固定相表面存在生化特异性亲和力，进行选择性分离固定相：生物专一性配基+载体流动相：一定pH的缓冲液第62页，共98页，星期日，2025年，2月5日具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留；没有亲和力作用的分子不被保留。用途：蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析第63页，共98页，星期日，2025年，2月5日第四节HPLC分离条件的选择根据vanDeemter方程和色谱分离方程式选择分析条件在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即：H=A+Cu第64页，共98页，星期日，2025年，2月5日（1）固定相：①粒度小，均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力；②改进结构，采用大孔径和浅孔道的表面多孔型载体或全多孔微粒型载体，减少滞留流动相传质阻力。第四节HPLC分离条件的选择第65页，共98页，星期日，2025年，2月5日（2）流动相：低粘度的流动相——增大组分在溶剂中的扩散系数Dm——减少传质阻力（3）流速：最佳流速在流速很小处，减小流速有利提高柱效常采用比最佳流速高数倍的流速——加快分析速度第四节HPLC分离条件的选择第66页，共98页，星期日，2025年，2月5日（4）柱温：提高柱温——降低流动相粘度——减少传质阻力——分辨率降低，柱寿命短，易产生气泡，一般在室温下进行第四节HPLC分离条件的选择第67页，共98页，星期日，2025年，2月5日第五节HPLC的建立与应用一、建立HPLC分析方法的一般步骤1、根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种HPLC分离方式。材料来源、浓度范围组分特性、结构、分子量、溶解性等第68页，共98页，星期日，2025年，2月5日

一、建立HPLC分析方法的一般步骤第69页，共98页，星期日，2025年，2月5日三、色谱柱柱长15~30cm，内径4~5mm基质(硅胶或高分子聚合物微球)功能层(固定在基质表面对样品分子保留起实质作用的有机分子或功能团)第25页，共98页，星期日，2025年，2月5日四、检测系统用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。溶质性检测器：仅对被分离组分理化特性响应紫外、荧光、电化学检测器总体检测器：对试样和洗脱液总理化性质响应示差折光，电导检测器第26页，共98页，星期日，2025年，2月5日石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液四、检测系统1、紫外检测器微量吸收池，光程为2-10mm