基于胚胎干细胞研究三唑类杀菌剂的发育毒性.pdf

摘要

农药残留造成的食品安全和环境污染一直备受关注。三唑类杀菌剂（TFs）因其

广谱、高效、长效等优点，被广泛用于农业生产中，以保护多种作物。它们在施用过

程中可渗透到附近的土壤和水环境中，而且由于其具有长期保留、生物降解性有限、

易于在环境中移动等特性，对土壤和水生生物产生有害影响。有证据表明，在非目标

物种中，动物和人类可能通过食道、呼吸道和皮肤接触途径暴露于TFs，导致内分泌

干扰作用、生殖毒性、心脏毒性、肝毒性、神经毒性等不良反应。然而，TFs是否具

有发育毒性效应及其相关作用机制尚不明确。小鼠胚胎干细胞（mESCs）具有发育成

为神经、心脏等多种细胞类型的潜能，是研究发育毒性的重要工具。因此，本研究基

于mESCs及其3D拟胚体（EB）和神经分化模型，揭示TFs在胚胎发育早期的不良

发育毒性结局，并阐明其分子起始事件，旨在为TFs的健康效应评估提供实验数据

和理论支持。主要研究内容如下：

1、本部分研究首先在体外细胞活力实验中发现，TFs对mESCs的细胞活力有时

间和剂量依赖效应，结合TFs环境暴露浓度，选择0.5μM的亚致死浓度作为后续分

化实验的暴露浓度。然后，构建基于mESCs的3DEB分化模型，通过形态学观察，

发现在EB形成过程中，mESCs首先变成“米粒”聚集体，然后向实心黑球转化，最

后慢慢空泡化；借助实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测发现，外、中、内三胚层标

志物（Fgf5、Mixl1、Gata6）在分化不同窗口期时间依赖性显著表达增加；而TFs暴

露后，能够显著抑制标志物Fgf5、Mixl1的转录表达，提示TFs的潜在发育毒性。

2、为了深入探究TFs造成发育毒性的分子机制，我们将目光指向与发育息息相

关的视黄酸（RA）信号通路。本部分研究中，首先分析了六种TFs暴露对RA信号

传导中视黄酸合成酶（Aldh1a2）、视黄酸结合蛋白（Crabp1，Crabp2）、视磺酸羟化

酶（Cyp26a1）、RA受体（Rara）、视黄醇结合蛋白（Rbp1、Rbp4）和视黄醇脱氢酶

（Rdh1）等基因的影响。实验结果显示，在EB分化过程中，对照组RA信号通路相

关基因表达有所升高，与此同时，在每个EB分化节点，TFs会相应的上调RA相关

基因，尤其是在第7天时，苯醚甲环唑（DIF）显著上调三个RA信号传导相关基因

的表达（Crabp1、Rbp1、Rbp4），而氟硅唑（FLU）处理组则显著上调六个RA信号

传导相关基因（Aldh1a2、Crabp2、Cyp26a1、Rara、Rbp1、Rbp4）。酶联免疫吸附实

验（ELISA）结果显示，TFs暴露EB14天后，DIF和FLU处理组会相应增加细胞内

I

RA总含量。分子对接和分子动力学模拟发现，TFs能与RA关键受体亚型RARα稳

定结合。分子力学/泊松-波尔兹曼表面积（MM/PBSA）法计算得到的结合自由能表

明范德华能是TFs与RARα结合的主要驱动力，而极性溶剂化能是结合的主要抑制

力。其中，DIF与RARα的对接结合能最低，而FLU与RARα可以形成三个氢键且

MM/PBSA结合自由能最低。由此提示，DIF和FLU具有更强的RA介导的发育毒

性。

3、本部分研究中，通过建立mESCs单层神经分化模型探究TFs潜在的神经发

育毒性。在本部分mESCs体外神经分化实验中发现，TFs有效的促进了神经分化标

志物（Dcx、Map2）的表达，促进细胞内钙离子的增加，扰乱5-羟色胺（5-HT）神经

递质代谢。组蛋白修饰在神经发育过程中发挥重要的调控作用，为此通过RT-PCR实

验检测了TFs对组蛋白H3K27me3去甲基转移酶（Kdm6a、Kdm6b）和甲基转移酶

（Ezh2）的影响，发现TFs能够干扰组蛋白去甲基转移酶Kdm6b的表达。此外，分

子对接分析、聚类分析和多元线性回归分析揭示了DIF和FLU相比于其他TFs对于

mESCs神经分化进程有着更强的促进作用。进一步通过染色质免疫沉淀分析发现DIF

和FLU通过显著降低5-羟色胺受体Htr2c基因启动子区H3K27me3的富集改变5-

HT表达。以上结果表明TFs能