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灵芝及灵芝提取物中β-葡聚糖的测定

1范围

本文件规定了灵芝及灵芝提取物中β-葡聚糖的分光光度检测方法。

本文件适用于灵芝子实体，灵芝孢子粉和灵芝提取物中β-葡聚糖的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1灵芝

灵芝俗称灵芝草、菌灵芝，在分类学上隶属担子菌门，伞菌纲，多孔菌目，灵芝科，灵芝属，包括赤芝和紫芝。

3.2灵芝孢子粉

灵芝子实体在成熟时弹射出的担孢子粉。

3.3灵芝提取物

适时采收成熟的新鲜灵芝子实体，烘干后采用热水浸提(或酒精提取)、真空浓缩、喷雾干燥等工艺，得到的灵芝浸有粉，是灵芝粉高倍浓缩而成的灵芝精华。

3.4β-葡聚糖β-glucan

一种多糖化合物，由葡萄糖分子通过β-1,3-和β-1,6-糖苷键连接而成，可溶于水的一系列高分子化合物。

4原理

灵芝子实体，灵芝孢子粉和灵芝提取物中β-葡聚糖和α-葡聚糖经水提取，使用α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶(糖化淀粉酶)酶解α-葡聚糖成单糖和寡糖；使用纤维素酶酶解纤维素成单糖和寡糖；使用蛋白质酶酶解蛋白质成氨基酸；乙醇沉淀β-葡聚糖，单糖、寡糖和氨基酸溶于乙醇被除去；β-葡聚糖经水溶解，在硫酸的作用下，先水解成单糖，并迅速脱水形成糖醛化合物，与苯酚形成黄色化合物，在485nm下具有特征吸收，与标准系列比较定量。

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5试剂和材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。

5.1试剂

5.1.1硫酸(H?SO?)。

5.1.2无水乙醇(C?H?O)。

5.1.3苯酚(C?H?OH)。

5.1.4盐酸(HCI)。

5.1.5氢氧化钠(NaOH)。

5.1.6β-葡聚糖对照品(CAS:9012-72-0,纯度≥98%)。

5.1.7α-淀粉酶(CAS:9000-85-5,20000-60000U/mL)。

5.1.8纤维素酶(CAS:9012-54-8,≥45U/mg)。

5.1.9蛋白酶(CAS:9014-01-1,≥200U/mg)。

5.1.10淀粉葡萄糖苷酶(CAS:9032-08-0,≥10万U/mL)。

5.1.11盐酸溶液(0.2mol/L):取17.00mL盐酸在搅拌状态下缓慢加入到800mL水中，混匀，冷却后用水稀释至1000mL,即得。

5.1.12氢氧化钠溶液(0.2mol/L):取8.00g氢氧化钠在搅拌状态下缓慢加入到800mL水中，混匀，冷却后用水稀释至1000mL,即得。

5.1.13β-葡聚糖对照品溶液制备(0.1mg/mL):精密称取β-葡聚糖对照品10mg,加水溶解并定容至100mL,混匀，即得0.1mg/mL的β-葡聚糖对照品溶液。

5.1.14苯酚溶液(50g/L):称取苯酚5.0g,加水溶解并定容至100mL,混匀，即得。

5.1.1580%乙醇溶液：量取200mL水加入到800mL无水乙醇中，混匀，即得。

6仪器与设备

6.1分光光度计。

6.2分析天平：感量为0.00001g和0.01g。

6.3电热恒温振荡水浴锅：温度波动±1℃。

6.4冰箱。

6.5离心机：转速不低于3000r/min。

6.6漩涡混合振荡器。

6.7pH计。

6.8样品粉碎机。

6.90.45mm标准网筛。

7分析步骤

7.1样品前处理

7.1.1样品制备

取不少于200g具代表性样品，用样品粉碎机粉碎(灵芝孢子粉和灵芝提取物等粉状样品无须粉碎),过0.45mm标准网筛，将样品装于密封容器中，保存备用。

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7.1.2样品提取

取样品0.5g(精确到0.01g),放入锥形瓶或50mL离心管中，加入10mL水，将样品涡旋至充分混合，用氢氧化钠溶液(5.1.11)调节溶液至pH6.9,加入0.1mL淀粉酶，并在20℃恒温水浴振荡2小时酶解。用盐酸溶液(5.1.10)将溶液的pH值调至5.0加入10mg纤维素酶，并在37℃恒温水浴酶解2小时。用氢氧化钠溶液(5.1.11)将溶液的pH值调至7.5,向溶液中加入约50mg的蛋白