镉对河南华溪蟹过氧素免疫应答的影响.pdf

中文摘要

过氧素（Peroxinectin，Px）是具有粘附特性和过氧化物酶活性的细胞粘附因子，

能够介导免疫细胞的吞噬、凝集和包裹，并参与调控机体的抗氧化水平，在甲壳动物

的免疫应答中发挥关键作用。为了解过氧素的免疫功能，首先，通过RACEPCR

克隆得到了河南华溪蟹（Sinopotamonhenanense）的过氧素基因并将其命名

为ShPx，基于生物信息学的研究手段，对ShPx基因序列信息和进化地位进

行了鉴定分析，利用qPCR的方法探究了ShPx组织分布情况，接着通过实

时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹的方法，分别检测了嗜水气单胞菌

（Aeromonashydrophila）刺激、镉暴露、镉与细菌联合攻毒三种处理方式

下河南华溪蟹血淋巴和鳃组织中ShPx基因和ShPx蛋白表达变化。与此同时，

免疫荧光的方法对血淋巴中ShPx蛋白进行了亚细胞定位，免疫组化方法探

究了镉与细菌联合攻毒对鳃组织的影响。另外，利用原核表达系统表达了过

氧素结构域重组蛋白，完成了表达条件的优化和纯化鉴定，利用重组蛋白开

展了自由基清除能力实验。主要研究结果如下：

1.河南华溪蟹过氧素基因的克隆鉴定与生物信息学分析

克隆得到的ShPx基因cDNA序列共有2930bp，其中有2307bp的开

放阅读框，可翻译成768个氨基酸，预测ShPx的蛋白质分子量大小为84.38

kDa，含有保守的过氧化物酶结构域和粘附基序，氨基酸序列与日本大眼蟹

（Macrophthalmusjaponicus）相似性最高为76.04%。qPCR检测发现ShPx基

因在河南华溪蟹的血淋巴中表达量最高。

2.镉与细菌胁迫后过氧素表达变化情况

qPCR和Westernblot的结果显示细菌刺激后ShPx和ShPx的表达水平

显著升高，ShPx参与了溪蟹的抗菌免疫应答；单独镉处理后ShPx的表达水

平无显著性差异；镉与细菌联合攻毒中发现，镉暴露会抑制ShPx的表达进

而影响免疫应答。另外，免疫荧光的方法观察到血淋巴中ShPx主要分布在

细胞质中。

3.河南华溪蟹过氧素的过氧化物酶结构域原核表达

成功构建了四种表达过氧化物酶结构域（peroxidase）的原核表达质粒，

I

表达载体分别是pET32a(+)、pGEX-4T-1、pET28a(+)、pCold-TF，分别诱导表达了

大小为81.7、72.4、60、108.2kDa的重组蛋白；完成了rShPeroxidase诱导表达的条

件优化，发现rShPeroxidase仅在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达，在BL21(DE3)中无

明显表达，pCold-TF载体能够增强rShPeroxidase的可溶性，其他载体诱导表达的重

组蛋白主要为包涵体沉淀。

4.重组蛋白rShPeroxidase的纯化鉴定与自由基清除能力检测

利用镍柱亲和层析纯化得到了rShPeroxidase，免疫印迹结果显示rShPeroxidase

能够与抗His标签的单克隆抗体和抗ShPeroxinectin多抗结合，超滤浓缩后检测了重

组蛋白的浓度为1.44mg/mL，通过DPPH法检测发现重组蛋白的自由基清除

率达到32.23%，相当于6.441μgTrolox/mL，具有抗氧化能力。

综上所述，本研究探讨了镉对河南华溪蟹过氧素免疫应答嗜水气单胞

菌感染的影响，通过原核表达完成了ShPx抗氧化功能的初步探究，对河南

华溪蟹抗氧化系统调节机制做出补充，有助于深入理解甲壳动物的先天性免

疫，为水产养殖提供科学依据。

关键词：河南华溪蟹；嗜水气单胞菌；过氧素；先天性免疫；原核表达；镉

II

ABSTRACT

Peroxinectin(Px)isacelladhesionfactorw