血红蛋白作为催化剂高灵敏测定过氧化氢.pptVIP

血红蛋白作为催化剂高灵敏测定过氧化氢报告人:刘立宇本文采用血红蛋白作为过氧化物酶的替代物，用于催化H2O2氧化对甲基酚的反应体系。从而建立了高灵敏测定痕量H2O2的荧光分析法。引言痕量H2O2的测定不论是在临床生物化学还是在环境化学中都有重要意义。酶法测定H2O2一般是基于过氧化物酶催化H2O2氧化底物的反应来实现的。01本文用Hb作为催化剂催化H2O202氧化对甲基酚的反应，建立了测定03H2O2的高灵敏荧光分析方法。实验部分仪器与试剂实验方法仪器RF-5301PC荧光仪；SFM-25荧光仪；PH-3C数字型精密酸度计；GS501超级恒温槽。试剂血红蛋白生化试剂，配成1×10-5mol/L的水溶液；对-甲酚(99%)移取105.6μL,用二次蒸馏水稀释至100mL，得1×10-2mol/L的储备液；H2O2：移取0.1mL30%的分析纯过氧化氢稀释至100mL，得1.064×10-2mol/L的储备液，棕色瓶装，冰箱保存，使用时依实验需要进行稀释。所用其他试剂除注明外，均为分析试剂，所用水为二次蒸馏水。在10mL比色管中依次加入系列H2O2溶液；1×10-3mol/L对甲基酚1.0mL；pH=10.3的NH3-NH4Cl缓冲溶液3.0mL；1×10-5mol/L血红蛋白0.50mL。用二次水定容，混合均匀后，室温放置10min，测定产物在激发波长318nm，发射波长427nm处的荧光强度。12结果与讨论体系的荧光光谱血红蛋白的催化活性比较过氧化氢测定条件的选择分析方法特性干扰情况样品测定用血红蛋白催化对甲基酚与H2O2的反应得到的荧光产物为2,2’-二羟基–4，4’-二甲基联苯，其荧光的激发和发射光谱如图1（a），最大激发和发射波长为λex/λem=318nm/427nm。需要指出的是，血红蛋白在本实验条件下亦产生微弱的荧光，这是由于其分子中肽链上的色氨酸和酪氨酸所致。然而其最大激发和发射波长为λex/λem=318nm/427nm（如图1b）对本体系只产生微弱的本底值。0102体系的荧光光谱血红蛋白的催化活性比较基于血红蛋白的上述结构特点，我们研究了对甲基酚浓度对血红蛋白催化反应速率的影响情况。实验结果显示，当对甲基酚浓度较低时，其与反应速率成正比，表现为一级反应。随着对甲基酚浓度的增高，表现为混合级反应。当对甲基酚浓度大于3×10-4mol/L时，反应速率不再上升，此时反应速率与对甲基酚浓度无关，表现为零级反应。血红蛋白的催化活性比较利用Linewear-Burk图，由截距和斜率求得Vm=1.6min-1，Km=8.75×10-4mol/L，再由方程：Vm=Kcat[E0]求得酶催化的转换数Kcat=6.4×106L/mol·min。按同样方法实验测得了氯化血红素和合成的环糊精-氯化血红素（β-CD-Hemin）等过氧化物模拟酶的Km、Vm和Kcat值(表1)。比较发现，这3种铁卟啉化合物对底物对甲基酚的催化氧化活性顺序为：Hb＞β-CD-Hemin＞Hemin血红蛋白的催化活性比较酸度及氨浓度对甲基酚浓度血红蛋白（Hb）的浓度过氧化氢测定条件的选择酸度及氨浓度酸度是酶催化反应需要用缓冲溶液严格控制的条件之一。我们比较了NH3-NH4Cl、甘氨酸-NaOH、硼砂-NaOH、NaHCO3及混合酸-NaOH等缓冲体系。发现在NH3-NH4Cl缓冲溶液中，当pH10.3时产物的荧光强度最大。同时我们固定这一酸度实验了NH3浓度对体系荧光强度的影响情况，结果显示的最佳氨浓度是0.03mol/L。表明血红蛋白的催化活性也可被氮配体（如NH3）所增强。对甲基酚浓度对甲基酚作为酶催化反应的氢供体，浓度太低，将使反应不完全而导致信号太弱；浓度太高，亦可使信号损失，并且造成浪费和环境污染。为此，本实验选择的对甲基酚浓度为1×10-4mol/L。