重组DNA-分子克隆技术.pptVIP

表达产物的应用05表达产物的分离和纯化04目的基因的表达及检测03受体细胞的建立和转化02表达载体的选择和构建01克隆基因的表达表达载体的选择和构建表达载体的选择原核表达体系大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，运用大肠杆菌表达载体符合下述标准：含大肠杆菌适宜的选择标志具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子含适当的翻译控制序列和翻译起始点等含有合理设计的多接头克隆位点，以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理很难表达大量的可溶性蛋白。真核表达体系与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA；将表达载体导入真核细胞的过程称转染，常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。几种重要的PCR衍生技术反转录PCR技术原位PCR技术实时PCR技术PCR扩增结果实例克隆载体的选择质粒：存在于细菌染色体外，小型闭合环状双链DNA分子，可独立自主进行复制，含筛选标记，含多种限制性内切酶的单一切割位点，可插入目的基因。噬菌体：λ噬菌体、MB载体。可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。柯斯质粒与酵母人工染色体载体：用于插入大DNA片段。12010203040506病毒载体：TMV，CaMV，PVX等，瞬时表达常用。病毒增殖水平较高,??可使伴随的外源基因高水平表达；病毒增殖速度快,??外源基因在很短时间(通常在接种后1~2??周内)可达最大量的积累；病毒基因组小,??易于进行遗传操作,??大多植物病毒可以通过机械接种感染植物,??适于大规模商业操作;??宿主范围广,??一些病毒载体能侵染农杆菌不能或很难转化的单子叶、豆科和多年生木本植物,??扩大了基因工程的宿主范围;??病毒颗粒易于纯化,??可显著降低下游生产成本。所以植物病毒是外源基因的瞬时高效表达载体。第3步：外源基因与载体的连接即DNA的体外重组。这种DNA重组是靠DNA酶将外源DNA与载体共价连接的。1．粘性末端连接(1)同一限制酶切割位点连接由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。那么，当这样的两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。(2)不同限制酶切割位点连接由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同类型的粘性末端，即配对末端粘端连接CCGGCCGGGGCCGGCCCGGCCGGCCGGCCGGCCCGGGGCCHapⅡT4-DNA连接酶HapⅡ0102限制性内切酶作用产生的平端粘端经特殊酶处理变为平端平端连接平端连接AGCTTCGAAluⅠDNA连接酶AGCTAGCTTCGATCGAAluⅠ同聚物加连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶作用下，在DNA片段制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。同聚物加尾连接01同聚物加尾连接025’035’045’055’06AAA07AAA08TTT09TTT10TdT酶11连接酶由平端加上带有新的酶切位点的寡核苷01酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行02连接。03人工接头连接人工接头连接BamHIBamHIBamHI重组DNA导入受体细胞根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化、转染和感染等不同手段。感受态细胞。经一定方法处理(如CaCl2处理)后具备接受外界DNA能力的大肠杆菌。受体菌应为安全无毒菌株，且为限制酶缺陷型及重组缺陷型。01转化、转染及感染