微生物免疫学分析方法.pptVIP

免疫磁（性）分离技术5.免疫磁（性）分离技术（2）应用：美国环保局1996年开始采用免疫磁力分离等技术对隐孢子虫进行分析检测，提出了单独检测隐泡子虫的UAS-EPA1622方法，并于1997年l月将其作为一个正式的检测标准发布。由于贾第鞭毛虫免疫磁力分离系统的建立落后于隐饱子虫，于1998年10月才被认可，因此，EPA于1999年2月又发布了能同时检测隐抱子虫和贾第鞭毛虫的检测方法，称其为USEPA一1623方法。US一EPA1623方法是目前国际上应用最广泛的一套隐抱子虫卵囊和贾第鞭毛虫检测方面的标准方法。US-EPA1623方法，包括浓缩、分离和鉴定3个步骤，即采用滤筒过滤，免疫磁珠分离和免疫荧光显微镜来检测和计数隐抱子虫卵囊和贾第鞭毛虫抱囊，并借助DAPI染色和微分干涉显微镜观察其内部的特征结构来证实卵囊和袍囊的存在。值得指出的是，隐抱子虫和贾第鞭毛虫的检测费用高，每个样品试剂费用在2000元左右。5.免疫磁（性）分离技术（3）优缺点：免疫磁分离法是从不同异质性物质中分离纯化靶分子的一有效方法。在大多数情况下，免疫磁分离法也是分离特异性靶分离物最容易的方法。尽管像那些与基于抗体方法一样的交叉反应也存在，但在大多数情况下产生的一些非特异性信号都不会造成影响。和任何一种微生物方法一样，这种分离方法也需要进行方法的优化和合适的选择(如微量离心分离或柱基质分离)。离子交换凝胶过滤6.Western免疫印迹检测技术（1）原理：Western免疫印迹检测分为三步，以确定可能存在于环境样品中的许多其他非靶抗原混合物中的靶抗原的存在。第一种技术是先用点杂交方法使样品中的抗原与带标记的抗体结合，用电泳分离出与带标记的抗体杂交的抗原。在点杂交中，环境中的样品直接加到硝酸纤维薄膜，然后再与标记抗体杂交并检测信号的强弱。第二种技术，首先将样品中的抗原按相对分子质量大小进行电泳分离，将已分离的样品转移到固体支特物上(硝酸纤维薄膜)，然后此膜再与酶标记的或者放射性元素标记的抗原特异的抗体一起温育，再加上酶的底物或放射自显影的胶片，以检测靶抗原的存在。这两种方法(点杂交和电泳分离法)均能反映抗原的存在，并巨显示其相对数量。如果用电泳分离的手段，还可以检测并帮助确定抗原分子大小。电泳分析法及检测过程详见图。6.Western免疫印迹检测技术6.Western免疫印迹检测技术电泳7.免疫亲和层析（1）原理：利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。抗体用化学方法被结合到惰性支持基质上（常为玻璃、凝胶或塑料珠），用此种基质填充成层析柱，将包含抗原的样品过层析柱，抗原将被选择性停留在柱子上。样品全部通过层析柱后，由于pH的改变导致抗原与抗体分开，被纯化的抗原可以通过改变柱子的pH而被洗脱下了，然后抗原被洗脱过柱，以高度纯化的形式被收集起来。这个方法能高效地同时进行纯化和浓缩。7.免疫亲和层析（2）应用：许多类型的真菌可产生吡喃糖氧化酶。此酶在氧存在的条件下催化D-葡萄糖氧化形成2-脱氢-D-葡萄糖和过氧化氢。这种酶在很多工业制造中很重要，帮助催化合成不同碳水化合物产物的反应。基于此原因，需要有有效的纯化吡喃糖氧化酶的方法。Schafer等(1996)描述了利用免疫亲和层析方法来有效地纯化从真菌产生的吡喃糖氧化酶。他们利用吡喃糖氧化酶的特异性抗体构建了一个免疫亲和柱，用以纯化从菌丝体抽提物中得到的此酶。抽提物可首先通过过滤制备得到真菌菌丝体，然后在匀浆器中匀化后，加热抽提物，离心初步沉淀密度大的大颗粒杂质。再将菌丝体抽提物加至免疫亲和柱上以结合吡喃糖氧化酶，通过此方法可得到71%产率的高度纯化的酶。因而免疫亲和层析是从复杂样品中分离纯化和浓缩抗原，包括有活隆的酶的最高效的方法之一。7.免疫亲和层析（3）优缺点：免疫亲和层析对于从不均一样品中高速纯化特殊的物质来说是一种非常有效的方法。但这个技术也遇到了一些问题，如，样品的浓缩应受到限制，若样品太混浊，层析柱可能阻塞。而样品的浓度也可能是个问题，样品物质在洗脱后可能仍有部分残留在基质上。8.免疫细胞化学分析（1）原理：免疫细胞化学分析用于检测和确定细胞内靶抗原的细胞定位，免疫细胞化学的目的是确定靶抗原位于细胞中的哪一部位，例如通过这种方法可以确定特定蛋白存在于细胞质中还是细胞膜上，许多情况下，光学显微镜可以用来确定真核细胞中抗原的位置，在免疫细胞化学中，电子显微镜也经常用于提高分辨率和放大被检的区域。许多类型的抗体标记可用于电子显微镜，包括像胶体金这样的重金属、辣根过氧化酶一样的酶类和铁蛋白质等，铁蛋白标记可以作为电