向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准(DB37∕T3104-2018).pdf

ICS67.060

B21

向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准

2018-02-02发布

山东省质量技术监督局发布

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由山东省农业厅提出。

本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。

本标准主要起草单位：山东农业大学、北京德农种业有限公司。

本标准起草人：张春庆、赵洪春、郑建鹏、温大兴、李岩。

本标准为首次发布。

I

向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准

1范围

产物检测等技术要求。

本规程适用于向日葵品种和杂交种种子纯度的室内快速鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB3543种子检验技术规程

GB20464农作物种子标签通则

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

杂交种

各种直接用于生产的杂交向日葵一代种子。

3.2

品种纯度

品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。

3.3

标准样品

能够充分代表种或品种特征特性的种子样品，或具备指定特征、特性样品。

3.4

引物

的互补链。

4原理

1

凝胶电泳分离，并通过染色显示DNA指纹谱带类型。不同向日葵品种由于遗传组成不同，基因组中DNA

简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可通过PCR扩增、电泳、染色程序获得的DNA指纹图谱加以区

分，从而对不同品种进行鉴定。杂交种纯度鉴定时，可从附表中选取亲本有差异的SSR引物。品种纯度

鉴定时，从附表中选择生产上常用品种间有差异的引物。

5仪器与试剂

5.1仪器

电子天平，水平摇床，双垂直板电泳槽，PCR仪，电泳仪，高压灭菌锅，观片灯。

5.2试剂

丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、谷氨酸、乙二胺四乙酸二钠、硼酸、过硫酸铵、四甲基乙二胺(TEMED)、

均为分析纯，所用水均为去离子水)。

6溶液

6.1提取液

称取0.56g氢氧化钾于100mL烧杯中，加去离子水溶解并定容至100mL,4℃贮存备用。

6.230凝胶溶液

至1000mL,4℃贮存备用。

6.35×TBE

6.4催化剂

称取10g过硫酸胺于100mL烧杯中，加去离子水溶解并定容至100mL,4℃贮存备用。

6.5电极缓冲液

取5×TBE200mL,用去离子水定容至1000mL。

6.6染色液

称取1g硝酸银溶于500mL去离子水中。

6.7显色液

称取10g氢氧化钠溶于500mL去离子水中，用时加2mL甲醛。

7操作程序

2

7.1DNA提取

DNA样品，用于PCR扩增时DNA样品模板量为2μL。

7.2扩增体系

7.3多重PCR扩增程序

通用多重PCR扩增程序采用“两段循环模式”:

a)预变性(94℃,5min);

的多对引物的退火温度从高到低的顺序逐一退火，每个退火温度的退火时间为20s;延伸

(72℃,30s);

并(70℃,50s);

7.4扩增产物检测

可用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，也可用高通量检测设备，对PCR产物进行检测。聚丙烯酰胺凝胶电

泳检测程序如下。

7.4.1凝胶制备

入板中，插入梳子，10min左右聚合，拔出梳子，吸取多余的水，装板。

7.4.2点样

用微量移液器取2ul体系加入样品槽，每加一个样品后，清洗移液器两次，区分不同引物加marker。

7.4.3电泳

加样完毕后，加入电极缓冲液，上槽电极缓冲液要没过矮玻璃板，下槽电极缓冲液要没过玻璃板，

将电