2024_2025年高中生物专题5DNA与蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段二教案新人教版选修1.docVIP

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多聚酶链式反应扩增DNA片段

学问?巧学

一、PCR原理

1.多聚酶链式反应（又称PCR技术）是一种体外快速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。

2.用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制过程类似。

要点提示DNA的两条链是反向平行的。为了明确表示DNA的方向，通常将DNA的羟基末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从头起先合成DNA，而只能从引物的3′端延长DNA链。

辨析比较DNA聚合酶和DNA连接酶

（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。

（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不须要模板。

3.在80～100℃

疑点突破TaqDNA聚合酶是从Thermusaquaticus菌提取的热稳定性酶，分子量大约为94kDa。这种酶的自然形式可在74℃

二、PCR的反应过程

PCR一般要经验三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延长三步。

1.变性当温度上升到90℃

2.复性温度下降到50℃

3.延长温度上升到72℃

要点提示PCR的反应过程和DNA的复制过程的区分：体外DNA进行、不需解旋酶、条件不同。PCR反应须要在肯定的缓冲溶液中供应：DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时通过限制温度使DNA的复制在体外反复进行。

三、试验操作

1.用微量移液器，依据下列配方在微量离心管中依次加入各组分

PCR反应体系的配方

10倍浓缩的扩增缓冲液 5μL

20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1μL

20mmol/L的引物Ⅰ 2.5μL

20mmol/L的引物Ⅱ 2.5μL

H2O 28～33μL

1～5U/mL的TaqDNA聚合酶 1～2U

模板DN A5～10μL

总体积 50μL

2.参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序

循环数

变性

复性

延长

第1次

94℃

——

——

30次

94℃

55℃

72℃

最终1次

94℃

55℃

72℃

问题?探究

问题1PCR技术怎样扩增DNA?

探究:待扩增DNA模板加热变性后，两引物分别与两条DNA链的两端序列实现特异性复性结合。此时，两引物的3′端相对，5′端相背，扩增的片段由5′端向3′端延长。在适当的pH和离子强度下，由TaqDNA聚合酶催化引物的延长。

上述反应过程是通过温度限制来实现的。热变性—复性—延长的一个周期过程称为一个PCR循环。PCR全过程就是在适当条件下的这种循环的多次重复。首次PCR中延长的产物在进入其次次循环变性后，再与引物互补，充当引导DNA合成的新模板。因此，其次轮循环后，模板由首轮循环后得到的4条增为8条（包括原始模板在内），以此类推，以后每一循环后的模板均比前一循环增加1倍。从理论上讲，扩增DNA产量可呈指数上升，即n个循环后，产量为2n拷贝。

问题2引物的特点是什么？

思路:引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

探究:（1）引物长度：15～30bp，常用为20bp左右。

（2）引物扩增跨度：以200～500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

（3）引物3′端的碱基，特殊是最末及倒数其次个碱基，应严格要求配对，以避开因末端碱基不配对而导致PCR失败。

（4）引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。

典题?热题

例1关于PCR引物的下列说法，不正确的是（）

A.引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补，并能引导模板DNA的互补链合成的（脱氧）核苷酸序列

B.引物常依据须要扩增的目标DNA的碱基序列用化学合成的方法获得

C.DNA聚合酶只能使DNA链从引物的3′端起先向引物的5′端延长

D.引物的3′端必需具有游离的-OH基团

解析：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；延长DNA链是从5′端向3′端延长。