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摘要
新冠肺炎疫情在全世界蔓延，造成了超过一亿人感染，因此人们迫切需要发现
MproMpro
能够抵抗新冠病毒感染的药物。目前针对于特效药的开发主要是通过抑制
蛋白酶的活性从而阻断病毒在宿主细胞内增殖过程来达到目的。人体Furin蛋白酶负
S
责病毒表面刺突蛋白的切割加工，在新冠病毒侵入宿主细胞过程中也发挥着十分
重要的作用。因此新冠特效药研发除了抑制Mpro蛋白酶活性外，还可以从抑制人体
Furin蛋白酶活性出发。目前针对新冠病毒主蛋白酶的抑制剂主要可以分为肽和非类
肽抑制剂两大类，未见同时抑制两种蛋白酶的双功能抑制剂研究。本研究首先构建
pET-29b-Mpro重组载体，并转化到E.coliBL21中进行表达纯化获得Mpro蛋白酶，
15%SDS显示目的蛋白质分子量大约为34kDa。随后分析实验室保存的不同
potatoIEglinCrBTIDCHPLUTIMpro
来源的的胰蛋白酶抑制剂（、、、）对蛋白酶
IC8.54μM31.125μM194.722μM51.28μM
的抑制作用，其50值分别为、、、。其中，
EglinC蛋白对Mpro蛋白酶的抑制效果最好，作为用于后续新冠病毒蛋白酶双功能
抑制剂的研究。
ZDOCKEglinCMpro
利用服务器来对与蛋白酶之间进行了分子模拟对接，根
据对接结果，对EglinC蛋白的关键氨基酸位点分别进行了定点突变，结合对Mpro
蛋白酶的抑制活性测定，相比野生型，筛选出EglinCD46E突变体对Mpro蛋白酶
tm
活性的抑制IC50达到0.129μM。随后利用Superdex200凝胶层析、Gator生物膜干
涉（BiolayerInterferometry,BLI）技术，体外分析了野生型EglinC及其突变体EglinC
D46EMproFRET
与蛋白酶之间的结合情况，进一步通过（荧光共振能量转移）揭
示了EglinC及其EglinCD46E突变体对于Mpro蛋白酶抑制作用。
最后，利用多点突变技术成功筛选出具有双功能抑制作用的EglinC三突变体
(EglinCP42K/L45R/D46E)MproFurinIC20.455
，其抑制和蛋白酶活性的值分别为
50
µM和16.47µM。
围绕EglinC对Mpro蛋白酶抑制活性，开展的EglinC蛋白进行突变改造，不
仅增强了其对Mpro蛋白酶的抑制作用，同时获得了具有双功能抑制（同时抑制Mpro
与Furin蛋白酶活性）的突变体。这一发现可为EglinC蛋白用作新冠特效药的研发
和应用提供理论指导和依据。
I
ABSTRACT
TheCOVID-19epidemichasspreadaroundtheworld,causingmorethan100
millioninfection
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