高效毛细管电泳在蛋白质分析中应用.pptVIP

蛋白质分析核酸分析及DNA排序

analysisofnucleicacidsandsequenceofDNA重要分析手段；图，酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；蛋白质的尺寸分离蛋白质的尺寸分离或分子量测定，是化学等研究中的重要工作，通常利用超速离心、质谱、凝胶排斥色谱、SDS等方法完成。利用毛细管电泳有较其他方法的优点：

１.只需消耗纳升级的样品；

２.可在短时间内进行重复和自动化的测定３.如果能获得准确的分子量标准，可以比较准确的测定未知蛋白质的分子量；

４.利用紫外等进行柱上检测，可以实现定量分析等；

蛋白质尺寸分析的关键，首先是筛分介质的选择，其次是缓冲体系的确定，此外还需需要仔细考虑进样、分离电压和电泳温度等因素。常用的筛分介质有两大类，一是各种凝胶，应用于CGE,适合于蛋白质分离的凝胶有线性聚丙烯酰胺、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖等。二是水溶性高分子溶液或称非胶筛分介质，用于NGCE，最好选用紫外透明或吸收较弱的高分子，例如葡聚糖、聚乙二醇等。蛋白质对毛细管内壁的吸附某种程度上限制了毛细管电泳在该领域的应用。影响毛细管电泳分离蛋白质效率及重现性的最主要因素是毛细管壁对蛋白质的吸附,吸附作用的大小取决于毛细管材料、蛋白质的等电点、缓冲溶液的pH值等多种因素。存在的问题毛细管内壁对蛋白质产生吸附的原因毛细管电泳中的蛋白质吸附,可源于疏水作用、静电作用和其它多种两相分配机制。通常情况下碱性蛋白的静电吸附最为突出,在常用缓冲溶液的pH下(pH=4~8),管内壁的硅羟基发生解离,使管内壁带负电荷,蛋白质在低于等电点时会带上正电荷,在高于等电点时带负电荷。若缓冲溶液的pH值低于蛋白质等电点,蛋白质则吸附H+而带正电荷,由于静电相互作用,蛋白质与管壁发生吸附当pH值增大到接近等电点时,蛋白质显中性,不带电;pH值继续增大(超过等电点),蛋白质带负电,此时与毛细管壁的SiO-产生排斥作用,不再发生吸附。(a)碱性蛋白质(pI=8)所带电荷量随pH的变化曲线;(b)在pH=4时,碱性蛋白质(pI=8)与毛细管壁发生吸附解决办法1、极端pH值法缓冲溶液pH值通过影响柱壁与溶质的电荷差异,从而改变其间的相互作用。在低pH下,硅羟基主要以不带电的质子化形式存在,壁电荷非常小,可以减少吸附。在高pH值下,内壁表面SiOH基大部分电离带负电荷,与溶液中带负电荷的蛋白质产生库仑排斥作用,从而有效地抑制了管壁的吸附。在CE分离中,除了背景电解质外,常常还在缓冲溶液中添加某种成分,常用添加剂有:表面活性剂,如季铵盐和氟化的阳离子表面活性剂;中性盐,如磷酸盐、硫酸钾等;胺类,三乙醇胺、三乙胺、N-乙基二乙醇胺、N,N,N??,N??-四甲基-1,3丁二胺(TMBD)等;有机溶剂,包括醇类、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜等。1上述两种方法只能从一定程度上降低蛋白质吸附,而且pH值过高(或过低),小分子添加剂浓度过大都会导致蛋白质聚集和变性。2添加小分子添加剂、聚合物涂覆毛细管内壁抑制蛋白质吸附化学键合涂层的涂覆过程如图2所示,一般分为两大步:首先,硅烷化试剂与毛细管内壁的SiOH反应生成Si-O-Si结构固定在管壁内表面;然后,通过硅烷化试剂末端双键与适宜单体共聚生成聚合物覆盖在毛细管内表面,形成永久涂层。常见的化学键合聚合物涂层有以下几种:聚乙烯醇(PVA)聚N,N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)聚丙烯酰胺(PAA)聚乙二醇(PEG)通过共价键与毛细管壁结合的涂层寿命长,稳定性好,分离效率高,已在毛细管电泳中获得广泛应用,但是化学键合的过程中涉及毛细管硅烷化和引发单体聚合两步反应,一方面受两步反应的转化率影响,Si-OH很难被完全屏蔽;另一方面,毛细管内的聚合反应很难控制,容易造成涂层的不均一性、不规整性,甚至阻塞毛细管。化学键合的交联的PVA涂层对4种碱性蛋白质实现第2次和第902次分离的电泳图谱样品浓度:50ug/mL的(1)细胞色素C,(2)溶解酵素,(3)胰蛋白酶原,(4)胰凝乳蛋白酶原。分离条件:毛细管,内径50μm,总长48cm(有效长度40cm);注入,3kV,5s;缓冲液,40mM磷酸钠;分离,309V/cm物理吸附的毛细管涂层通过物理作用吸附在毛细管壁上的聚合物涂层相对于化学键合涂层优势在于:(1)涂层制备过程简单易