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一种可快速检测大肠杆菌O157:H7的纸基传感器的制备与应用

食源性致病菌是引发公共卫生安全事件的重要因素之一，其在食品的制造、销售、处理和消费等过程中都有传播的可能性[1]。在食源性致病菌中，大肠埃希氏菌是易导致出血性腹泻和肠炎的致病菌，O157:H7则是典型的菌属，该致病菌通常存在于未经加工的蔬菜、肉制品中，若摄入被大肠杆菌O157:H7污染的食品，会对人体造成较大伤害[2]，因此需要建立一类适用于现场快速检测的方法来对食品进行筛查，尽量减少致病菌带来的危害。

大肠杆菌O157:H7的检测方法有传统的培养法、分子生物学检测、免疫学方法[3]、生物传感器法和核酸适配体法等。传统的检测方法的检测周期长、对检测人员经验要求高，免疫学和分子生物学检测方法的操作复杂、无法满足现场快速检测的要求，因此如何在低成本、高效、快速的前提下进行检测成为亟待解决的问题。本研究制备了一种基于适配体的快速检测纸基传感器，用于大肠杆菌O157:H7的检测。该传感器有较好的特异性和重复性，可在15min内快速检测出大肠杆菌O157:H7并应用于实际样品检测中。

1材料与方法

1.1材料与试剂

硝酸镓；99.99%六水合硝酸锌；硝酸铬；氨水（28wt%）；盐酸；异丙醇；氢氧化钠；超纯水；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）；N-羟基丁二酰亚胺（NHS）；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）；3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）；无水乙醇；羟基化聚乙二醇羧酸（HO-PEG12-COOH）；PBS缓冲液（0.01mol·L-1，pH=7.4）；Tris-HCl缓冲液（10mmol·L-1，pH=7.2）；功能化核酸适配体及其互补序列；whatman1号定性滤纸；吸水棉；底板；大肠埃希氏菌O157:H7（ATCC35150）；麦氏比浊管；琼脂平板。

1.2仪器设备

CP-225D天平，德国赛多利斯；便携式pH计，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；XPDHG-9246A数显鼓风干燥箱，上海析谱仪器有限公司；马弗炉，英国CARBOLITE；DF-101S集热式磁力搅拌器，上海力辰邦西仪器科技有限公司；MilliqAcademic超纯水机，美国密理博公司；KQ-50E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；水热反应釜，力辰科技；TG-16离心机，上海屹谱；TalosF200透射电子显微镜，赛默飞；D8ADVANCEX射线衍射仪，布鲁克AXS；RF-6000荧光分光光度计，日本岛津公司；Zeta电位分析仪，PALS美国布鲁克公司；WFH-204B手提式紫外分析仪，杭州齐威仪器有限公司。

1.3实验方法

1.3.1材料合成

本文采用一步水热法[4]合成红色长余辉纳米材料ZnGa2O4:Cr3+，首先用超纯水分别配制2mol·L-1硝酸镓、1mol·L-1硝酸锌、1mmol·L-1硝酸铬溶液，再移取1mL硝酸镓、2mL硝酸锌、4mL硝酸铬的水溶液于烧杯中混合均匀，加超纯水定容至30mL，定容过程中用氨水调节溶液pH至9.0。随后，将混合溶液于室温搅拌0.5h使其预反应，预反应结束后将溶液转移到聚四氟乙烯内衬反应釜（内衬体积50mL）中，封好后将反应釜放入220℃烘箱中（事先预热），水热反应约10h。反应结束后，待反应釜自然冷却到室温，将产物分散于0.01mol·L-1盐酸中，充分混合后离心收集，加入过量异丙醇离心洗涤3次，最后用超纯水洗涤1次，于真空干燥箱中干燥备用。

1.3.2适配体选择

参考文献[5]合成修饰过的大肠杆菌O157:H7适配体及DNA互补链，用以修饰长余辉材料的适配体的5端均修饰了羧基，3端修饰了生物素，其余适配体5端均用生物素进行了修饰，所有适配体和DNA互补链均委托上海生工生物工程有限公司合成，所合成的DNA序列见表1。

表1适配体或DNA序列表

1.3.3适配体功能化材料

（1）羟基化修饰。将200mg红色长余辉纳米材料放入5mmol·L-1氢氧化钠溶液中并超声分散，在室温条件下搅拌24h，而后放入离心机中2700r·min-1离心分离5min，将离心产物依次用超纯水（自制）洗涤3次，洗涤所得产物于真空干燥箱中，在10-2Pa、50℃条件下干燥6h，收集备用。

（2）氨基化修饰。取羟基化的红色长余辉材料100mg，超声分散于40mLDMF中，边磁力搅拌边向溶液中加入APTES，加入量约为40μL；滴加结束后将其置于80℃下恒温搅拌12h，2700r·min-1离心3min，分离收集底部沉淀；用DMF洗涤沉淀3次，无水乙醇洗涤2次，最终产物在室温下真空干燥。

（3）适配体功能化