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团体标准

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饮料和包装饮用水中霉菌酵母菌快速计数—荧光染色方法

Rapiddetectionmoldandyeastinbeverages-Fluorescentstainingmethods

（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国出入境检验检疫协会发布

Ⅱ

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件主要起草单位和起草人：默克化工技术（上海）有限公司，可口可乐饮料（上海）有限公司-亚太技术中心，中农孚德检测技术（北京）有限公司，通标标准技术服务（青岛）有限公司，上海康识食品科技公司。

本文件参与起草单位及起草人：陈洁，付敏，晨凡，王亦宁，李梦兰，王琦，周婀，单萌，XX，XX等。

本文件为首次发布。

本文件知识产权归中国出入境检验检疫协会所有。任何单位或个人未经许可，不得以营利为目的，印制、出版、翻译、转发或复制全文或部分文字。

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饮料和包装饮用水中霉菌酵母菌快速计数-荧光染色方法

范围

本文件描述了饮料和包装饮用水中霉菌和酵母菌荧光染色快速计数方法。

本文件适用于饮料、包装饮用水以及经稀释可过滤的饮料浓缩汁（葡萄浓缩汁、苹果浓缩汁等）、固体饮料中霉菌和酵母菌的快速测定。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件:不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB4789.15食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数

GB4789.25食品安全国家标准食品微生物学检验酒类、饮料、冷冻饮品采样和检样处理

GB4789.45微生物检验方法验证通则

GB19489实验室生物安全通用要求

术语和定义

GB4789.15以及GB4789.25中相关术语适用于本文件

4方法原理

本方法基于荧光染色技术和膜过滤技术，对滤膜上收集的具生物活性的霉菌和酵母菌进行荧光染色并计数，该染色剂对霉菌酵母菌不具有毒性，对霉菌酵母菌的菌落生长没有任何影响。荧光染色试剂本身不具备荧光特性，但会被微生物代谢过程中产生的酶所分解，释放出荧光素，荧光素在活细胞内积累并发出荧光，该荧光被EZ-Fluo?/Milliflex?Quantum微生物快速检测系统捕获并放大，从而实现对霉菌酵母菌的快速计数。

5设备和材料

恒温培养箱：28℃±1℃，32.5℃±2.5℃。

无菌移液管或移液器及相应吸头：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)

pH计或精密pH试纸。

5.4EZ-Fluo?/Milliflex?Quantum微生物快速检测系统

5.5EZ-Fit过滤系统或者Oasis一体化过滤系统（含泵，泵真空压力小于75kpa）

5.6Petri-PadTM无菌平皿

5.7S-Pak?或者EZ-Pak?无菌滤膜:孔径0.45μm，直径47mm，材质MCE（混合纤维素）

5.8EZ-Fit?一次性滤杯（含滤膜），Microfil滤杯（不含滤膜）

5.9无菌平头镊子

6培养基和试剂

6.1马铃薯葡萄糖琼脂（按照附录A.1)，也可以使用商品化的马铃薯葡萄糖琼脂培养基

6.2无菌磷酸盐缓冲液（按照附录A.2)

6.3无菌生理盐水（按照附录A.3)

6.4无菌蒸馏水

6.5默克EZ-Fluo?/Milliflex?Quantum荧光染色试剂（按照附录B)

7检测程序

图1霉菌和酵母荧光染色法检验程序

8.操作步骤

8.1样品前处理

8.1.1包装饮用水、不含固形物的饮料可直接滤膜过滤。

8.1.2饮料浓缩汁和固体饮料样品，取25mL（g）样品置于225mL无菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水/蒸馏水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，制成1:10的样品匀液。根据样品污染程度的估计选择1～3个适宜稀释度的样品匀液（原液）滤膜过滤。

8.1.3对于含有固形物的饮料，采用带滤网的均质袋进行初过滤，制成1:10的样品匀液，根据样品污染程度的估计选择1～3个适宜稀释度的样品匀液（原液）进行滤膜过滤。

8.2样品过滤

8.2.1参照GB4789.25的要求，将5.8中过滤装置安装在5.5的过滤系统上，如果需要安装滤膜，参照5.7