蛋白质和多肽的氨基酸序列分析.ppt

二、肽链的部分降解三、肽段的分离提纯第三节亚基拆离、肽链降解和肽段的分离一、亚基拆离和二硫键的断裂第87页，共130页，星期日，2025年，2月5日一、亚基拆离和二硫键断裂蛋白质由一条以上的肽链组成时，肽链间的结合可能是靠非共价键结合，也可能是靠共价键结合。在进行肽链顺序分析时，首先要将它们分离开来。若多亚基间以非共价键连接，在温和条件下即可以拆离亚基，如改变溶液pH，将pH降低到3～4或升高到9～10；或者加入变性剂，如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍等。例如，血红蛋白经8mol/L脲处理后，α及β链可以得到分离；核酮糖二磷酸羧化酶在0.2mol/L巯基乙醇及1%SDS溶液中保温1小时，大小亚基便相互分开。拆离后的亚基可以用凝胶过滤方法进行分离。第88页，共130页，星期日，2025年，2月5日拆分靠共价键结合的因比较牢固须用特殊的化学作用使其破坏。最常见的是半胱氨酸残基经氧化作用而形成胱氨酸残基，即二硫键结构。第89页，共130页，星期日，2025年，2月5日1．过甲酸氧化法优点：能将巯基（-SH）和二硫键（-S-S-同时氧化成磺基，生成的磺酸基很稳定，肽链不再重新形成二硫键，便于肽链分离。缺点：氧化过程中，同时将蛋磺酸的侧链氧化成亚砜，色氨酸的侧链也遭破坏。第90页，共130页，星期日，2025年，2月5日2．还原法一般可使用过量巯基化合物，如β-巯基乙醇。在室温或pH8～9条件下放置数小时，即可使二硫键还原成巯基。加入8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍使蛋白质变性。在这种情况下，还原剂才能有效地作用于暴露的二硫键。二硫键还原后，需要用巯基保护试剂，如碘乙酸，以防其重新被氧化。第91页，共130页，星期日，2025年，2月5日2、PTC-AA实验操作：氨基酸或样品在Eppendorf管中真空干燥后溶解在50ul偶联试剂(乙醇:三乙胺:水＝7:1:1)中。此溶液在旋转真空干燥后再次溶解于50ul偶联试剂中，然后加入2ulPITC(异硫氰酸苯酯)，反应混合物在250C下保温15min，再次旋转真空干燥，真空度(1.3~13Pa)。如此生成的PTC-AA溶解在适量流动相A中，取一部分上柱定量分析。第55页，共130页，星期日，2025年，2月5日仪器为BeckmanGoldSystemHPLC仪，反相柱RP-18(250mm×4.6mm)或PTH-柱，254nm检测。流动相：A50mmol/L乙酸钠，pH6.8B50mmo1／L乙酸钠，pH6.8:乙腈＝50:50HPLC柱采用水浴夹套40℃恒温，并用5％流动相B平衡。梯度条件是：0min,5%B,5min,5％-15％B,10min,15％B；30min,15％~60％B,40min,60~5％B流速是1ml／min。第56页，共130页，星期日，2025年，2月5日第57页，共130页，星期日，2025年，2月5日3、茚三酮法实验操作：水解后氨基酸样品溶解于Na-S样品稀释液中100u1上样分析，实际进样量50ul(100pmol~5nmol，均呈线性)。第58页，共130页，星期日，2025年，2月5日仪器：Beckman6300氨基酸分析仪。流动相：Na-E0.0min温度：0.0min48℃Na-D27.80min11.8min65℃Na-F39min32.5min77℃Na-R76.00min50min48℃Na-E77.00-90min流速：缓冲液14ml/h茚三酮7ml/h第59页，共130页，星期日，2025年，2月5日第60页，共130页，星期日，2025年，2月5日第二节

蛋白质的末端测定第61页，共130页，星期日，2025年，2月5日蛋白质的末端分析的目的