转基因技术与作物育种.pptVIP

真空渗入法。将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。这是一种简便、快速、可靠而且不需要经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转移方法，具有良好的研究与应用前景。原生质体共培养法。原生质体法是指在原生质培养的早期，将携带外源目的基因的农杆菌与原生质体共同培养，农杆菌的Ti或Ri上携带有目的基因的T—DNA区段就会随着外源信号分子的诱导而导入原生质体的核内，并整合到受体基因组上。外源基因直接导入法外源基因直接导人技术是一种不需借助载体介导，直接利用理化因素进行外源遗传物质转移的方法，主要包括化学刺激法、基因枪轰击法等。化学刺激法。化学刺激法是借助于聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)或者多聚—L—鸟苷酸(PLO)等细胞融合剂的作用，使细胞膜表面电荷发生紊乱，干扰细胞间的识别，使细胞膜之间、DNA／RNA与细胞膜之间形成分子桥，促使细胞膜间的相互融合(接触和粘连)和外源DNA／RNA进入原生质体。基因枪轰击法。基因枪轰击法也称为微弹轰击技术和粒子枪法，其基本原理是将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，然后借助高压动力射人受体细胞或组织，当微粒上的DNA进入细胞后将整合到植物基因组中并得以表达。按照动力来源可将基因枪分为火药动力基因枪、高压气体动力基因枪和高压放电动力基因枪。由于基因枪法的操作对象可以是完整的细胞或组织，这就克服了受体材料的限制，而且不必制备原生质体，因此实验步骤简单易行，具有相当广泛的应用范围，已经成为研究植物细胞转化和创造转基因植物的最有效方法之一。到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。高压电穿孔法。又称为电击法，是利用高压电流脉冲在细胞质膜上形成瞬间微孔，使DNA直接通过微孔或者作为微孔闭合时伴随发生的膜组分重新分布进入细胞质并整合到宿主细胞中。与原生质体融合和磷酸钙沉淀法相比，通过高压电穿孔法获得的转化植株外源DNA整合拷贝数较低，对受体细胞的选择性不强，但是要获得对特定的宿主细胞的最佳转化条件(如电场强度、电击时间等)需要大量的前期工作。微注射法。此法是利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受体细胞固定，然后将供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。所用受体一般是原生质体或生殖细胞，对于具有较大子房或胚囊的植株则无须进行细胞固定，在田间就可以进行活体操作，被称为“子房注射法”或“花粉管通道法”。微注射法的优点是可以进行活体操作，不影响植物体正常的发育进程。田间子房注射操作简便、成本低。但只对子房比较大的植物有效，对于种子很小的植物操作要求精度高，需要显微操作，转化率也相对较低，而且转基因后代容易出现嵌合体。其他直接转化方法。随着科技的不断前进，人们先后又发明了多种直接转化方法，如超声波介导法、脉冲电泳法和离子束介导等方法，但是由于上述方法技术还不成熟、转化率低，有的原理不清楚或者是所需设备太昂贵，因此在实际中的应用受到了限制。转化体的筛选和鉴定转化体的筛选外源目的基因在植物受体细胞中的转化频率往往是相当低的，在数量庞大的受体细胞群体中，通常只有为数不多的一小部分获得了外源DNA，而其中目的基因已被整合到核基因组并实现表达的转化细胞则更加稀少。为了有效地选择出这些真正的转化细胞，必要使用特异性的选择标记基因进行标记。常用选择标记基因包括抗生素抗性基因及除草剂抗性基因两大类，如卡那霉素抗性基因NPTⅡ和潮霉素抗性基因hpt，除草剂抗性基因bar基因和Glyphosate抗性基因epsps等。在实际工作中，是将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因并克隆到质粒载体上，与目的基因同时进行转化。当标记基因被导入受体细胞之后，就会使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力，抑制、杀死非转化细胞，转化细胞则能够存活下来。由于目的基因和标记基因同时整合进入受体细胞的比率相当高，因此在具有上述抗性的转化细胞中将有很高比率的转化细胞同时含有上述两类基因。转化体的鉴定通过选择压筛选得到的再生植株只能初步证明标记基因已经整合进入受体细胞，至于目的基因是否整合、表达还一无所知，因此还必须对抗性植株进一步检测。根据检测水平的不同可以分为DNA水平、转录水平和翻译水平的鉴定。转化体的安全性评价和育种利用通过上述鉴定证实携带目的基因的转化体，还必须根据有关转基因产品的管理规定、在可控制的条件下进行安全性评价和大田育种利用研究。从目前的植物基因工程育种实践来看，利用转基因方法获得的转基因植株，常常存在外源基因失活、纯合致死、花粉致死效应，以及目标性状明确的基因导入植物后由于插入位点的原因可能导致