限制性核酸内切酶消化DNA.pptVIP

******实验二限制性核酸内切酶消化质粒DNA01掌握限制性核酸内切酶消化质粒DNA的原理与方法。02了解酶切反应条件。一、实验目的01限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中某特定核苷酸序列，并在识别位点内或附近切割双链DNA的核酸内切酶。02在一定条件下（如合适温度、盐浓度等），它能在特定的切割位点裂解DNA分子中的磷酸二酯键而将双链DNA分子断开。二、实验原理二、实验原理类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端（3’突出和5’突出的单链末端）的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ、HindⅢ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。EcoRⅠ5ˊ-G↓AATTC-3ˊ5ˊ-GAATTC-3ˊ3ˊ-CTTAA↑G-5ˊ3ˊ-CTTAAG-5ˊ+HindⅢ5ˊ-A↓AGCTT-3ˊ5ˊ-AAGCTT-3ˊ3ˊ-TTCGA↑A-5ˊ3ˊ-TTCGAA-5ˊ+实验原理质粒是细菌细胞内独立于染色体之外能自主复制的双链环状DNA分子。本实验用到的是pGEM-TEasy质粒。二、实验原理凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA；开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂；线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同,因此电泳后呈3条带。超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质粒DNA。EcoRⅠ或HindⅢ可以将pGEM-TEasy质粒DNA切开成为线性DNA。用未经酶切的pUC质粒DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以推测酶切是否成功。

_+二、实验原理Marker12图片说明：1未经酶切的质粒DNA2经EcoRⅠ或HindⅢ酶切后的线性DNA和目的DNA3000bp2000bp1000bp600bp500bp目的DNA5×TBE缓冲液琼脂糖主要试剂：限制性核酸内切酶（EcoRⅠ、HindⅢ）质粒DNA上样缓冲液主要仪器：恒温水浴箱、离心机、电泳槽与电泳仪10×酶切缓冲液三、仪器与试剂四、实验步骤1.建立反应体系：0.5mL无菌的EP管(总体积20μL)2.37℃，水浴1h。3.低速短暂离心。4.加4μL上样缓冲液于离心管中混匀，1%琼脂糖凝胶电泳（100V,40min）。(取12μL点样)无菌双蒸水12μL质粒2μL10×buffer酶切缓冲液2μL内切酶EcoRⅠ4μL轻轻混匀，低速短暂离心五、实验结果质粒酶切电泳图1、操作时注意：水浴时，将EP管盖严，以防水进入管内。打开EP管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。分子生物学实验多为微量操作，注意吸样量的准确性。要求在冰上操作，并充分混匀。六、注意事项注意加样顺序；不使其污染与浪费；注意限制性内切酶体积不应大于反应总体积的1/10，避免星活性（产生星活性的原因：高甘油含量、酶量过大、低离子强度、高pH（8.0）、含有有机溶剂、非Mg2+的二价离子存在）。010203六、注意事项2.内切酶的使用时注意：六、注意事项质粒DNA对结果的影响：作为内切酶底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制作用可通过下列方式克服：增加酶作用单位数（10-20U/ugDNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂延长反应时间六、注意事项4、反应缓冲液的影响反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；Tris·HCl维持反应体系pH值在之间；NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：低盐（10mMNaCl)中盐（50mMNaCl）高盐（100mMNa