《马尾松组培苗松材线虫病抗性室内鉴定技术规程》.docx

Q/LB.□XXXXX-XXXX

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ICS

FORMTEXT65.020.01

CCS

FORMTEXTGXAS

FORMTEXTB16

团体标准

T/FORMTEXTGXASFORMTEXTXXXX—FORMTEXT2024

FORMTEXT?????

FORMTEXT马尾松组培苗松材线虫病抗性室内鉴定

技术规程

FORMTEXTTechnicalcodeofpracticeforindooridentificationofresistancetopinewiltdiseaseintissuecultureseedlingsofPinusmassonianaLamb

FORMDROPDOWN

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FORMDROPDOWN

FORMTEXT2024-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布

FORMTEXT2024-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施

FORMTEXT广西标准化协会??发布

STYLEREF标准文件_文件编号T/GXASXXXX—2024

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STYLEREF标准文件_文件编号T/GXASXXXX—2024

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马尾松组培苗松材线虫病抗性室内鉴定

技术规程

范围

本文件界定了马尾松（PinusmassonianaLamb）组培苗松材线虫病抗性室内鉴定与评价涉及的术语和定义，规定了松材线虫病抗性室内鉴定与评价技术中接种体制备、室内抗性鉴定、抗性评价等阶段的操作指示,描述了鉴定过程信息的追溯方法。

本文件适用于室内环境下对马尾松组培苗松材线虫病抗性的鉴定与评价。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T23476松材线虫病检疫技术规程

GB/T35342松材线虫分子检测鉴定技术规程

术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

混合株系mixedstrain

包含一定数量的能覆盖病害发生地区松材线虫病生态分布区域的致病性松材线虫混合在一起的株系。

室内鉴定indoorappraisal

在人工控制温度、湿度及光照条件的培养室内，鉴定马尾松组培苗在人工接种混合株系松材线虫病后的抵抗水平。

抗性评价evaluationofdiseaseresistance

根据接种混合株系松材线虫病后马尾松组培苗病害反应程度和抗病性等级的描述。

接种体制备

线虫分离

混合株系线虫的来源分离方法如下：

在病害发生地选取由松材线虫致死的当年枯死树，分别在树杆或粗枝上取30cm左右的木段用于松材线虫取样；

选取木段中5cm大小的木块用自来水洗净，99.9％酒精液冲淋1遍，灭菌水洗3次后切碎；

按照GB/T23476中的贝曼漏斗法分离线虫，并使用螺口指形瓶收集，同一个疫区的样品中收集到的松材线虫群体称为一个分离株系；

不同疫区的松材线虫株系按照“地理来源—年份—序列号”进行命名。

线虫鉴定

将分离株系的松材线虫按照GB/T23476的规定进行镜检、形态鉴定和分子生物学鉴定。

线虫保存

将鉴定后的分离株系松材线虫放在0.1％硫酸链霉素溶液中表面消毒5min，使用灭菌水洗3次后，在超净工作台中将其接种到PDA平板培养基上生长良好的灰葡萄霉菌丝中，然后置于恒温培养箱中在25℃下进行培养保存备用。

线虫筛选

对分离株系线虫群体的筛选方法如下：

以自由授粉的混合种子培育的1年生黑松苗（Pinusthunbergii）为接种材料；

在自然条件下的苗圃、大棚及适合松材线虫病发生的人工控制环境条件培养室内分别进行线虫接种测试；

每种环境设2个试验区，共6个试验区，每个分离株系松材线虫在各试验区内接种20株左右；

接种后3个月，根据苗木感病死亡情况筛选得到致病性强的线虫株系。

接种体扩繁

混合株系线虫的扩繁方法如下：

从筛选到的致病性强株系中各自挑出10头松材线虫，接种到PDA培养基的灰葡萄霉菌丝中，然后在25℃条件下进行恒温培养；

根据线虫繁殖情况，7d～15d后将有松材线虫的PDA培养基进行0.5cm×0.5cm大小的切块；

将其接种在长满灰葡萄霉菌丝的小麦培养基上进行25℃恒温大量增殖培养；

每个分离株系线虫接种在直径为9cm的4个培养皿中，7d～10d更换一次有灰葡萄霉菌丝的小麦培养基。

混合株系筛选

依据各筛选株系松材线虫的地理来源及其致病力分析结果，