高效液相色谱分析方法的建立.ppt

（有关色谱方程式的讨论）(1)分离度R与柱效的关系分离度R与理论塔板数n有关。由色谱分离方程式可得：因此可通过增加柱长提高分离度。然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！为提高柱效，用减小塔板高度H的方法比增加柱长更有效。2提高分离度的方法第63页，共79页，星期日，2025年，2月5日(2)分离度R与分配系数比?的关系?越大，柱选择性越好，对分离有利。?的微小变化可引起R较大改变。如，当?从1.01增加至1.10(增加9%)时，R则增加9倍(但?1.5,R增加不大)。改变?的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。(3)分离度R与容量因子k的关系k增加，分离度R增加，但分析时间也将增加。当k10，则R的增加不明显。通常k控制在1~10之间。最好1~5。改变k的方法有：适当增加柱温、改变流动相性质以及固定液膜厚度。第64页，共79页，星期日，2025年，2月5日容量因子（k）、柱效（H）及分配系数比（α）对分离度（R）的影响HH第65页，共79页，星期日，2025年，2月5日3分离条件选择的基本依据在分离多组分复杂混合物时，分子量相近、沸点差小及极性相似的组分，保留值相差小，分离较难。有必要设立一个指标，表征这种难分离的物质对。根据热力学参数对分离的影响，设立Sd值作为难分离物质对的量度。在一定的色谱条件下，规定：k1、k2为容量因子，β*为动力学系数(1)难分离物质对的预测k2/k1比值越小，β*越大，Sd值就越小，分离越难。k2/k1属于热力学参数，β*属于动力学参数。如温度如流速第66页，共79页，星期日，2025年，2月5日色谱分析样品预处理的主要目的将待测物质有效地从样品基质中释放出来，制成便于分析测定的稳定液体试样。如：中草药或中成药有效（指标）成分分析；体液中药物或代谢物含量的测定等。除去杂质，纯化样品，防止色谱柱的堵塞。如生物样品中的蛋白质、叶绿素、固体微粒等。富集浓缩样品或进行衍生化，以达到色谱分析的检测限。一、根据了解的样品信息以及分析目的，建立样品预处理方案第31页，共79页，星期日，2025年，2月5日进行样品预处理的必要性样品只有成为液体状态才能直接进行HPLC分析。虽然色谱分析具有很强的处理复杂样品的能力，但样品如果过于复杂（如中药饮片、中成药、生物样品分析等），若不进行必要的预处理，则会影响到分析的准确性，并且可能导致测定失败。任何先进的色谱技术都须有先进的样品处理技术相匹配，样品处理技术的适当与否，直接关系到色谱分析的成本、速度和实用性。第32页，共79页，星期日，2025年，2月5日样品预处理的种类物理的分离与浓缩技术过滤、沉淀分离、吸附、蒸馏、溶剂的挥发溶剂萃取回流、索氏提取、超声波提取固相萃取（SPE）吸附剂（硅胶、氧化铝）、高分子大孔树脂（苯乙烯－二乙烯苯）、离子交换树脂、键合硅胶等超临界流体萃取化学衍生化技术第33页，共79页，星期日，2025年，2月5日HPLC检测器应提供的功能对样品有响应，并有一个输出信号检测器响应值与样品浓度之间在一定的浓度范围内呈线性关系二、选择检测器、确定使用条件第34页，共79页，星期日，2025年，2月5日HPLC检测器可以分为：溶质性质检测器（Solutepropertydetectors）对溶质的物理或化学性质响应，一般不反映流动相的变化（选择型）整体性质检测器（Bulkpropertydetectors）不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！第35页，共79页，星期日，2025年，2月5日不同种类的检测器的分类整体性质示差折光检测器蒸发光散射检测器电导检测器溶质性质荧光检测器固定波长可变波长光电二极管矩阵电化学检测器放射化学检测器氮/硫检测器质谱检测器紫外/可见光检测器第36页，共79页，星期日，2025年，2月5日理想的HPLC检测器高灵敏度；可忽略基线噪音（信噪比高）宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应对流动相的压力、温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性低死体积非破坏性选择性（可降低分析组分色谱分离的压力）第37页，共79页，星期日，2025年，2月5日检