荧光定量原理与应用第二版.ppt

TaqMan缺点价格较高只适合于一个特定的目标不能进行融解曲线分析背景高第31页，共50页，星期日，2025年，2月5日兼容化学试剂总结结合于双链DNA的小沟中发夹型杂交探针水解型杂交探针（5‘-3’外切）延伸复性任何步骤定量和检测目标基因融解曲线分析SNP分析定量和检测目标基因SNP分析定量和检测目标基因信号检测工作原理有否淬灭剂化学试剂否有有主要应用范围第32页，共50页，星期日，2025年，2月5日荧光曲线随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图第33页，共50页，星期日，2025年，2月5日定量原理如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析引入两个概念：荧光阈值、Ct值第34页，共50页，星期日，2025年，2月5日定量原理荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)阈值线第35页，共50页，星期日，2025年，2月5日Ct值的概念定量原理Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数C(t)值C(t)值18.12+/0.04-阈值线第36页，共50页，星期日，2025年，2月5日提纲PCR简介荧光定量PCR技术原理荧光化学物质简介定量方法实时荧光定量PCR技术简介：第37页，共50页，星期日，2025年，2月5日绝对定量确定初始模板的准确含量需要标准曲线相对定量确定样品间初始模板的含量倍数差异相对标准曲线不使用标准曲线，利用Ct值计算ΔCt方法ΔΔCt方法（看家基因）Pfaffl方法（考虑扩增效率）Vandesompele方法（多看家基因）14500copies定量方法第38页，共50页，星期日，2025年，2月5日借助标准曲线由未知样品的C(t)值反推出其初始量得到未知样品初始量绝对值unknown104103Unknowncontains3108copies绝对定量第39页，共50页，星期日，2025年，2月5日ΔCT法相对定量无均一化处理均一化依赖于加样的一致性相对定量——ΔCTSample1Ct1(25)Sample2Ct2(22)ΔCT=Ct1-Ct2=25-22=3基因表达量Sample1/Sample2=2–ΔCT=2-3=1/8第40页，共50页，星期日，2025年，2月5日相对定量——ΔΔCTΔΔCT法相对定量考虑到了加样误差通常使用看家基因来完成均一化处理Sample1Ct1(25)Sample2Ct2(22)内参基因actinCt0120Ct0221ΔCT1=Ct1-Ct01=25-20=5ΔCT2=Ct2-Ct02=22-21=1ΔΔCT=ΔCT1-ΔCT2=5-1=4基因表达量Sample1/sample2=2-ΔΔCT=2-4=1/16第41页，共50页，星期日，2025年，2月5日SimpleComplex2??CT假定目的基因与看家基因的扩增效率都是100%只有一个看家基因PfafflModification考虑到扩增效率的影响只有一个看家基因VandesompeleMethod考虑到扩增效率的影响有多个看家基因相对定量第42页，共50页，星期日，2025年，2月5日利用相对标准曲线定量，定量结果相除得到倍数差别同时建立两条标准曲线一条目的基因的标准曲线至少再做一条看家基因的标准曲线借助标准曲线校准扩增效率的影响使用标准曲线法进行相对定量分析相对定量——标准曲线法第43页，共50页，星期日，2025年，2月5日进行可靠的定量实验需要对引物对进行优化设计用于优化扩增产物产量和特异性的参数引物设计扩增片段选择试剂的浓度循环条件变性温度和退火温度PCR体系优化第44页，共50页，星期日，2025年，2月5日利用动态温度梯度功能一次实现退火温度的优化退火温度的优化第45页，共50页，星期日，2025年，2月5日45oC55oC65o